實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:第三節(jié)　放射性同位素標(biāo)記核酸探針

最常用的同位素是α-³²PdNTP,³HdNTP,及³⁵SdNTP，多用缺品平移法、末端標(biāo)記法，隨機(jī)引物延伸法和反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記法。在以mRNA制備cDNA時(shí)，同時(shí)摻入標(biāo)記的脫氧核苷酸，制出cD－NA標(biāo)記探針。

一、缺口平移法

在適當(dāng)?shù)臐舛鹊腄Nase I作用下在一雙鏈DNA上制造一些缺口，再利用大腸桿菌DNA聚合酶I 的5’—3’外切酶活性依次切除缺口下游的核酸序列，同時(shí)將四種脫氧三磷酸核苷（其中一種用放射性標(biāo)記)利用該酶5’—3’聚合活性補(bǔ)人缺口，使缺口逐個(gè)平稱并在平移過程中形成標(biāo)記的新生核酸鏈。此法也適用于探針的非放射性標(biāo)記。如³²P標(biāo)記DNA探針（缺口平移法)：反應(yīng)體積為25μl，內(nèi)含0.3μgDNA片段，4μl 0.2μmol/L dNTP, 1.1×10⁶Bq [α-³²P]dATP,1μl2萬倍稀釋的DNA酶和2μl DNA聚合酶I，6μl緩沖液[為50mmol/l Tris·HCl(PH7.2)、10mmol/l MgSO₄、1mmol/L二硫蘇糖醇（DTT)和50μg/ml BSA]，反應(yīng)在14_℃進(jìn)行3h。標(biāo)記DNA經(jīng)Sephadex (G-50)柱層析回收。

二、末端標(biāo)記法

在大腸桿菌T₄噬菌體多聚核苷酸激酶（T₄PNK)的催化下，將γ-³²P-ATP上的磷酸連接到寡核苷酸的5’末端上。要求標(biāo)記的寡核苷酸5’端必須帶羥基。反應(yīng)式為：

此法適用于標(biāo)記合成的寡核苷酸探針。如將底物改為Bio –11 –dUTP，也可以在3’端標(biāo)記上一個(gè)生物素。

寡核苷酸³⁵S的3’—末端標(biāo)記法：將quanxiangyun.cn/pharm/下列液體依次加入Eppendorf管中。

寡核苷酸（1 pmol)1μl

10×Tailingbuffer 2μl

[α-³⁵S]2μl

雙蒸餾水14μl

末端脫氧核苷酸酶1μl（10Unit)

混合后，置于37^℃水浴中1.5h。取出反應(yīng)管放入冰水中5min。加入下列液體：

TRNA(25mg/ml)3μl

1×TE(pH8.0)180μl

酚100μl

CTAa100μl

充分混合2min。離心15000r/min 5min。將上清液（約200μl)移入新的Eppendorf 管中，然后加入下列液體：

4mol/L醋酸胺100μl

100%酒精800μl

混勻，置冰浴中，15min。再15000r/min離心10min，在管底可見一白色沉淀塊（含tRNA及寡核苷酸)。吸去管中液體，然后加入1000μl80%酒精，混合1～2min同上離心，吸除酒精（勿破壞沉淀塊)，將管置于40℃溫箱中5min。加入適量的1×TE（pH8.0)及0.5mol/l DTT溶解沉淀。標(biāo)記探針的最終濃度是0.5ng/μl,DTT的最終濃度為20mmol/μl。取出1μl標(biāo)記探針測(cè)定比放射性，應(yīng)在1.0×10dpm/μg以上。保存在-80℃中1～2個(gè)月。再次使用時(shí)應(yīng)考慮到放射性同位素的衰減量。

三、應(yīng)用特異單引物法標(biāo)記DNA探針

應(yīng)用探針DNA上的一個(gè)片段作為DNA引物，以環(huán)化探針DNA的重組質(zhì)粒DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下，通過變性，退火和延伸過程，使探針DNA得到標(biāo)記。反應(yīng)在0.5ml離心管內(nèi)進(jìn)行，總體積為25μl，內(nèi)含50mmol/l Tris—HCl pH7.5, 10mmol/L MgCl₂、BSa 5mmol/L、80ng引物DNA和0.1μg連接的DNA或0.1μg質(zhì)粒。反應(yīng)管在95℃變性5min，取出，稍離心，立即放入37℃C水浴保溫2min使DNA退火，加入1UE.coli DNA聚合酶I，在37℃進(jìn)行延伸反應(yīng)。對(duì)環(huán)化基因，延伸18min，對(duì)質(zhì)粒DNA延伸35min重復(fù)上述變性、退火和延伸過程1次。

四、雙引物法標(biāo)記DNA探針法

反應(yīng)在0.5ml管內(nèi)進(jìn)行，反應(yīng)體積為50μl，內(nèi)含50mmol/l Tris(pH7.5)、10mmol/l Mg－Cl₂、10mmol/L β-巰基乙醇和500μg BSA/ml，引物片段1和2各90ng，模板DNA0.1μg,[α-³²P]dCTp 1.5×10⁶Bq，dATp 、dGTP和dTTP各200μmol/L。標(biāo)記反應(yīng)包括3個(gè)步驟：

（1)變性：反應(yīng)管在95℃水浴5min，然后離心；

（2)退火：37℃水浴2min；

（3)延伸：加入DNA聚合酶i 1u，37℃水浴18min。重復(fù)上述變性、退火、延伸過程1～2次，分別進(jìn)行其標(biāo)記率測(cè)定：取0.5μl反應(yīng)液分別點(diǎn)于兩張濾紙片上，烤干。一張經(jīng)0.6mol/L三氯醋酸（TCA)、0.3mol/l TCA依次洗滌，每次10min，然后再用無水乙醇，醇醚混合液和乙醚洗滌各5min。兩張濾紙分別放入閃爍瓶內(nèi)，測(cè)定cpm值，達(dá)到10⁸cpm/μg DNA以上。

五、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)標(biāo)記高活性DNA探針

在0.5ml離心管內(nèi)進(jìn)行，反應(yīng)總體積為50μl，內(nèi)含模板DNA350ng,DNA引物各50pmol/L,dGTP、dCTP和dTTP各200μmol/L，[α-³²P]dATp 1.1×10⁶Bq，反應(yīng)緩沖液為67mmol/l quanxiangyun.cn/sanji/Tris—HCl pH8.8含2.5mmol/l MgCl₂、6.7mmol/L(NH₄)₂SO₄、10mmol/l β-巰基乙醇、170mg/l BSA、6.7μmol/l EDTA和40μl/ml二甲亞砜。將反應(yīng)管置于95℃水浴變性5min取出，加入Taq DNA聚合酶0.5～2u,在旋渦混合器上混勻簡(jiǎn)單離心一下，加入35μl石蠟油。放入65℃水浴2min，取出，立即進(jìn)入PCR循環(huán)：91℃變性30s,51^。C退火1min，68℃延伸2min。重復(fù)上述過程15次。最后將反應(yīng)管置65℃水浴5min。反應(yīng)完成，加入酵母tRNA10μg。分別測(cè)定參入和游離放射性計(jì)數(shù)，參入率為97.4%。標(biāo)記DNA探針經(jīng)醋酸鈉酒精沉淀回收。將沉淀溶于10mmol/l Tris—HCl 、EDTA(pH8.0)100μl。用PCR方法標(biāo)記的DNA探針特異性高，敏感性好，可測(cè)出的最低靶DNA量為10fg,利用PCR還可以作DNA探針的非放射性標(biāo)記。