免疫學和免疫學檢驗:第一節(jié)　放射免疫分析

放射免疫分析是由Yalow和Berson于1960年創(chuàng)建的標記免疫分析技術。由于標記物放射性核素的檢測靈敏性，本法的靈敏度高達ng甚至pg水平。測定的準確性良好，ng量的回收率接近100％。本法特別適用于微量蛋白質(zhì)、激素和多肽的定量測定。

一、基本原理

放射免疫分析的基本原理是標記抗原（Ag^*)和非標記抗原（Ag)對特異性抗體（Ab)的競爭結(jié)合反應。它的反應式為：

在這一反應系統(tǒng)中，作為試劑的標記抗原和抗體的量是固定的�？贵w的量一般取用能結(jié)合40％～50％的標記抗原，而受檢標本中的非標記抗原是變化的。根據(jù)標本中抗原量的不同，得到不同的反應結(jié)果。

假設受檢標本中不含抗原時的反應條件為：

4（Ag^*)＋2（Ab)→2（Ag^*Ab)＋2（Ag^*)（2)

在標本中存在抗原時，舉例如下：

4（Ag^*)＋4（Ag)＋（2Ab)→

1（Ag^*Ab)＋3（Ag^*)＋1（AgAb)＋3（Ag)（3)

當標記抗原、非標記抗原和特異性抗體三者同時存在于一個反應系統(tǒng)時，由于標記抗原和非標記抗原對特異性抗體具有相同的結(jié)合力，因此兩者相互競爭結(jié)合特異性抗體。由于標記抗原與特異性抗體的量是固定的，故標記抗原抗體復合物形成的量就隨著非標記抗原的量而改變。非標記抗原量增加，相應地結(jié)合較多的抗體，從而抑制標記抗原對抗體的結(jié)合，使標記抗原抗體復合物相應減少，游離的標記抗原相應增加，亦即抗原抗體復合物中的放射性強度與受檢標本中抗原的濃度呈反比（圖16-1)。若將抗原抗體復合物與游離標記抗原分開，分別測定其放射性強度，就可算性結(jié)合態(tài)的標記抗原（B)與游離態(tài)的標記抗原（F)的比值（B/F)，或算出其結(jié)合率[B/(B＋F)]，這與標本中的抗量呈函數(shù)關系。用一系列不同劑量的標準抗原進行反應，計算相應的B/F，可以繪制出一條劑量反應曲線（圖16-2)。受檢標本在同樣條件下進行測定，計算B/F值，即可在劑量反應曲線上查出標本中抗原的含量。

圖16-1 放射免疫分析原理示意圖

圖16-2 劑量反應曲線

（一)標記物

標記用的核素有放射γ射線和β射線兩大類。前者主要為¹³¹I、¹²⁵I、⁵⁷Cr和⁶⁰Co；后者有¹⁴C、³H和³²P。放射性核素的選擇首先考慮比活性。例如¹²⁵I比活性的理論值是64.38×10⁴GBq/g（1.74×10⁴Ci/g)，有較長半衰期的¹⁴C最大比活性是166.5GBq/g（4.5Ci/g)。兩者相比，1mol¹²⁵I或¹⁴C結(jié)合到抗原上，¹²⁵I的敏感度約比¹⁴C大3900倍。又因為¹²⁵I有合適的半衰期，低能量的γ射線易于標記，因而¹²⁵I是目前常用的RIA標記物。

（二)標記方法

標記¹²⁵I的方法可分兩www.med126.com大類，即直接標記法和間接標記法。

直接標記法是將¹²⁵I直接結(jié)合于蛋白質(zhì)側(cè)鏈殘基的酪氨酸上。此法優(yōu)點是操作簡便，為¹²⁵I和蛋白質(zhì)的單一步驟的結(jié)合反應，它能使較多的¹²⁵I結(jié)合在蛋白質(zhì)上，故標記物具有高度比放射性。但此法只能用于標記含酪氨酸的化合物。此外，含酪氨酸的殘基如具有蛋白質(zhì)的特異性和生物活性，則該活性易因標記而受損傷。

間接標記法（又稱連接法)是以¹²⁵I標記在載體上，純化后再與蛋白質(zhì)結(jié)合。由于操作較復雜，標記蛋白質(zhì)的比放射性顯著低于直接法。但此法可標記缺乏酪氨酸的肽類及某些蛋白質(zhì)。如直接法標記引起蛋白質(zhì)酪氨酸結(jié)構(gòu)改變而損傷其免疫及生物活性時，也可采用間接法。它的標記反應較為溫和，可以避免因蛋白質(zhì)直接加入¹²⁵I液引起的生物活性的喪失。下面介紹最常用的氯胺T直接標記法。

氯胺T是對甲苯磺基酰胺的N-氯衍生物的鈉鹽，在水溶液中逐漸分解形成次氯酸，是一種氧化劑。在偏堿溶液中（pH7.5)，氯胺T將¹²⁵I的I^－氧化為I⁺，I⁺取代蛋白質(zhì)酪氨酸苯環(huán)的氫，形成二碘酪氨酸。反應式如下：

放射性碘標記率的高低與抗原（蛋白質(zhì)或多肽)分子中酪氨酸的含量及分子中酪氨酸的暴露程度有關，當分子中含有較多的酪氨酸，又暴露在外時，則標記率就高。

標記方法：將純化抗原和¹²⁵I加入小試管底部，然后將新鮮配制的氯胺T快速沖入，混勻振蕩數(shù)十秒～2min后加入偏重亞硫酸鈉終止反應。再加入KI溶液稀釋。然后在葡聚糖G柱上分離，逐管收集。分別用井型閃爍計數(shù)器測定放射性強度（脈沖數(shù)/min,cpm)，前部為標記抗原峰，后部為游離¹²⁵I峰。在標記抗原峰試管內(nèi)加等量1％白蛋白作穩(wěn)定劑，此即為標記抗原液。

（三)標記物的鑒定

1．放射性游離碘的含量用三氯醋酸（預先在受鑒定樣品中加入牛血清白蛋白)將所有蛋白質(zhì)沉淀，分別測定沉淀物和上清液的cpm值。一般要求游離碘在總放射性碘的5％以下。標記抗原在貯存過久后，會出現(xiàn)標記物的脫碘，如游離碘超過5％則應重新純化去除這部分游離碘。

2．免疫活性標記時總有部分抗原活性損失，但應盡量避免。檢查方法是用小量的標記抗原加過量的抗體，反應后分離B和F，分別測定放射性，算出BT％。此值應在80％以上，該值越大，表示抗原損傷越少。

3．放射性比度標記抗原必須有足夠的放射性比度。比度或比放射性是指單位重量抗原的放射強度。標記抗原的比放射性用mCi/mg（或mCi/mmol)表示。比度越高，測定越敏感。標記抗原的比度計算是根據(jù)放射性碘的利用率（或標記率)：

如：5μghGH用2mCiNa¹²⁵I進行標記，標記率為40％，則

（四)抗血清的檢定

含有特異性抗體的抗血清是放射免疫分析的主要試劑，常以抗原免疫小動物誘發(fā)產(chǎn)生多克隆抗體而得�？寡�清的質(zhì)量直接影響分析的靈敏度和特異性�？寡�清質(zhì)量的指標主要有親和常數(shù)、交叉反應率和滴度。

1．親和常數(shù)親和常數(shù)（affinityconstant)常用K值表示。它反映抗體與相應抗原的結(jié)合能力。K值的單位為mol/L，即表示1mol抗體稀釋至若干L溶液中時，與相應的抗原結(jié)合率達到50％。抗血清K值越大，放射免疫分析的靈敏度、精密和準確度越佳�？寡�清的K值達到10⁹～10¹²mol/L才適合用于放射免疫分析。

2．交叉反應率放射免疫分析測定的物質(zhì)有些具有極為類似的結(jié)構(gòu)，例如甲狀腺素的T3、T4，雌激素中的雌二醇、雌三醇等。針對一種抗原的抗血清往往對于其類似物會發(fā)生交叉反應。因此交叉反應率反映抗血清的特異性，交叉反應率過大將影響分析方法的準確性。交叉反應率的測定方法為用與抗血清相應抗原及其類似物用同法進行測定，觀察置換零標準管50％時的量。以T3抗血清為例，置換零標準50％T3為1ng，其類似物T4則需200ng，則其交叉反應率為：1/200＝0.5％。

3．滴度滴度系指將血清稀釋時能與抗原發(fā)生反應的最高稀釋度。它反映抗血清中有效quanxiangyun.cn/pharm/抗體的濃度。在放射免疫分析中滴度為在無受檢抗原存在時，結(jié)合50％標記抗原時抗血清的稀釋度。

二、測定方法

用放射免疫分析進行測定時分三個步驟，即抗原抗體的競爭抑制反應、B和F的分離及放射性的測量。

（一)抗原抗體反應

將抗原（標準品和受檢標本)、標記抗原和抗血清按順序定量加入小試管中，在一定的溫度下進行反應一定時間，使競爭抑制反應達到平衡。不同質(zhì)量的抗體和不同含量的抗原對溫育的溫度和時間有不同的要求。如受檢標本抗原含量較高，抗血清的親和常數(shù)較大，可選擇較高的溫度（15～37℃)進行較短時間的溫育，反之應在低溫（4℃)作較長時間的溫育，形成的抗原抗體復合物較為牢固。

（二)B、F分離技術

在RIA反應中，標記抗原和特異性抗體的含量極微，形成的標記抗原抗體復合物（B)不能自行沉淀，因此需用一種合適的沉淀劑使它徹底沉淀，以完成與游離標記抗原（F)的分離。另外對小分子量的抗原也可采取吸附法使B與F分離。

1．第二抗體沉淀法這是RIA中最常用的一種沉淀方法。將產(chǎn)生特異性抗體（第一抗體)的動物（例如兔)的IgG免疫另一種動物（例如羊)，制得羊抗兔IgG血清（第二抗體)。由于在本反應系統(tǒng)中采用第一、第二兩種抗體，故稱為雙抗體法。在抗原與特異性抗體反應后加入第二抗體，形成由抗原－第一抗體－第二抗體組成的雙抗體復合物。但因第一抗體濃度甚低，其復合物亦極少，無法進行離心分離，為此在分離時加入一定量的與一抗同種動物的血清或IgG，使之與第二抗體形成可見的沉淀物，與上述抗原的雙抗體復合物形成共沉淀。經(jīng)離心即可使含有結(jié)合態(tài)抗原（B)的沉淀物沉淀，與上清液中的游離標記抗原（F)分離。

將第二抗體結(jié)合在顆粒狀的固相載體之上即成為固相第二抗體。利用固相第二抗體分離B、F，操作簡便、快速。

2．聚乙二醇（PEG)沉淀法最近各種RIA反應系統(tǒng)逐漸采用了PEG溶液代替第二抗體作沉淀劑。PEG沉淀劑的主要優(yōu)點是制備方便，沉淀完全。缺點是非常特異性結(jié)合率比用第二抗體為高，且溫度高于30℃時沉淀物容易復溶。

3．PR試劑法是一種將雙抗體與PEG二法相結(jié)合的方法。此法保持了兩者的優(yōu)點，節(jié)省了兩者的用量，而且分離快速、簡便。

4．活性炭吸附法小分子游離抗原或半抗原被活性炭吸附，大分子復合物留在溶液中。如在活性炭表面涂上一層葡聚糖，使它表面具有一定孔徑的網(wǎng)眼，效果更好。在抗原與特異性抗體反應后，加入葡聚糖－活性炭。放置5～10min，使游離抗原吸附在活性炭顆粒上，離心使顆粒沉淀，上清液中含有結(jié)合的標記抗原。此法適用于測定類固醇激素，強心糖苷和各種藥物，因為它們是相對非極性的，又比抗原抗體復合物小，易被活性炭吸附。

（三)放射性強度的測定

B、F分離后，即可進行放射性強度測定。測量儀器有兩類，液體閃爍計數(shù)儀（β射線，如³H、³²P、¹⁴C等)和晶體閃爍計數(shù)儀（β射線，如¹²⁵、¹³¹I、⁵⁷Cr等)。

計數(shù)單位是探測器輸出的電脈沖數(shù)，單位為cpm（計數(shù)/分)，也可用cps（計數(shù)/秒)表示。如果知道這個測量系統(tǒng)的效率，還可算出放射源的強度，即dpm（衰變/分)或dps（衰變/秒)。

每次測定均需作標準曲線圖，以標準抗原的不同濃度為橫坐標，以在測定中得到的相應放射性強度為縱坐標作圖（圖16-3)。放射性強度可任選B或F，亦可用計算值B/(B＋F)、B/F和B/B₀。標本應作雙份測定，取其平均值，在制作的標準曲線圖上查出相應的受檢抗原濃度。

圖16-3 放射免疫分析標準曲線示例