放射性標(biāo)記核酸探針在使用中的限制,促使非放射性標(biāo)記核酸探針的研制迅速發(fā)展,在許多方面已代替放射性標(biāo)記,推動分子雜交技術(shù)的廣泛應(yīng)用。目前已形成兩大類非放射標(biāo)記核酸技術(shù),即酶促反應(yīng)標(biāo)記法和化學(xué)修飾標(biāo)記法。
酶促反應(yīng)標(biāo)記探針是用缺口平移法,隨機(jī)引物法或末端加尾法等把修飾的核苷酸如生物素-11-dUTP摻入到探針DNA中,制成標(biāo)記探針,敏感度高于化學(xué)修飾法,但操作程序復(fù)雜,產(chǎn)量低,成本高。
化學(xué)修飾法是將不同標(biāo)記物用化學(xué)方法連接到DNA分子上,方法簡單,成本低,適用于大量制備(>50μg)如光敏生物素標(biāo)記核酸方法,不需昂貴的酶,只在光照10~20min,生物素就結(jié)合在DNA或RNA分子上。
非放射性標(biāo)記核酸探針方法很多,現(xiàn)介紹常用的幾種方法如下:
生物素標(biāo)記的核苷酸是最廣泛使用的一種,如生物素-11-dUTP,可用缺口平移或末端加尾標(biāo)記法。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)生物素可共價(jià)連接在嘧啶環(huán)的5位上,合成TTP或UTP的類似物。在離體條件下,這種生物素化dUTP可作為大腸桿菌多聚酶I(DNA酶I)的底物摻入帶有缺口的DNA或RNA,得到生物素標(biāo)記的核酸探針。這種標(biāo)記方法稱為缺口平移法。用標(biāo)記在DNA上的生物素與鏈霉親合素-酶(過氧化物酶或堿性磷酸酶)標(biāo)記物進(jìn)行檢測。
缺口平移法標(biāo)記生物素DNA探針:在硅化Eppendorf管(放入冰浴中)加下列反應(yīng)液:
待標(biāo)記DNA 0.1μg/μl 5μl
10×NTB 1μl
DNase I2pg/μl 1μl
消毒三蒸水 3μl 總體積達(dá)10μl
混勻,37℃,15min。離心10000r/min 1min后,放入冰浴中,繼續(xù)加入下列反應(yīng)液:
dNTP(ACG)0.5μg/ml2μl
Bio –11–dUTP 0.5μg/ml2μl
10×NTb 4μl
消毒三蒸水 31μl
混勻,短暫離心后,加入
DNA聚合酶I(5u/μl)1μl總體積50μl
混勻,14℃過夜(10h以上),加入
終止液 2μl
經(jīng)Sephadex –G –50柱分離,回收生物素標(biāo)記DNA。
10×NTB配法:500mmol/l Tris –HCl, Ph7.5;100mol/L MgCl2;80mmol/L β-巰基乙醇,500μg/ml BSA。
終止液:0.25mol/L EDTA, 10mg/ml tRNA和10mmol/l Tris –HCl (pH7.5)。
缺口平移法標(biāo)記探針少量多次標(biāo)記效果較好,即每次標(biāo)記DNA不超過1μ.Bio –11-dUTP要濃貯,分裝,-20。C保存,反復(fù)凍融常會降解失活。Bwww.med126.comio –11- dUTP貯存液:10mmol/L即100μg Bio-11-dUTP中加入11.6μl Bio-11 –dUTP稀釋液,分裝成3μl/支,-20℃保存。
地高辛-dUTP標(biāo)記DNA也可按此法進(jìn)行。
乙醇沉淀分離回收標(biāo)記DNA比較方便,即加入5μl4mmol/l LiCl,125μl冷乙醇,混勻,-20℃放置30min,12000r/min離心5min,去上清,用70%乙醇和無水乙醇洗沉淀物,倒置離心管,晾干,用消毒三蒸水5μl溶解沉淀物(0.1μg/μl)-20。C保存。用LiCl 可較好地分離DNA和可溶性核苷酸,因?yàn)閐NTPS的鋰鹽在乙醇中比鈉鹽溶解性更大。
光敏生物素有一個(gè)連接臂,一端連接生物素,另一端有芳基疊氮化合物。在可見光照射下,芳基疊氮化合物可能變成活化芳基硝基苯,很易與DNA或RNA的腺嘌呤N—7位置特異結(jié)合,大約每50個(gè)堿基結(jié)合一個(gè)生物素,所以只用于標(biāo)記大于200個(gè)核苷酸的片段。光敏生物素的醋酸鹽很易溶于水,與核酸形成的共價(jià)結(jié)合很穩(wěn)定。此法有以下優(yōu)點(diǎn):方法簡便易行,快速省時(shí),不需昂貴的酶和dUTP等;只需光照,探針穩(wěn)定,-20℃可保存12個(gè)月以上。適用于DNA和RNA,抗體和酶等的標(biāo)記。在原位分子雜交,斑點(diǎn)雜交和Southern印跡雜交中應(yīng)用,其特異性和靈敏性較高,價(jià)廉易購,國內(nèi)已有試劑盒供應(yīng),軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所馬立人教授等研制和生產(chǎn)的光敏生物素核酸探針和檢測試劑盒使用良好。
方法步驟:在一滅菌Eppendorf管中加待標(biāo)記DNa 5μg/10μl,在暗室中加入5μg/5μl光敏生物素,充分混勻,插入冰浴中,置特制光源下10cm處照射20min。加入100mmol/l Tris –HCl pH9.0, 1.0mmol/L EDTA10μl混勻。再加入等體積仲丁醇,混勻。離心1min(10000r/min)吸去上層仲丁醇,棄去。再加入仲丁醇25μl,重復(fù)提取游離的光敏生物素。吸去上層無色仲丁醇后,加入5μl 3mol/L醋酸鈉,充分混勻,加入冷無水酒精100μl充分混勻,沉淀標(biāo)記DNA,置-20℃過夜(或-70℃15min)15000r/min離心20min,沉淀物再用70%乙醇洗一次,離心,抽干,溶于0.1mmol/l EDTA或TE中,測定探針濃度,分裝,保存于-20℃。
生物素-補(bǔ)骨脂素是另一種生物素光敏物質(zhì),在長波長紫外線照射下與嘧啶堿基發(fā)生光化學(xué)反應(yīng),加成到DNA中,去除小分子后,得到生物素標(biāo)記核酸探針。此法可標(biāo)記單鏈或雙鏈DNA或RNA,及寡核苷酸。靈敏度與放射性探針相當(dāng)。標(biāo)記方法:取DNA或片段0.5μg加50μlTE(pH8.0)緩沖液中,再加入5μlg生物素-補(bǔ)骨脂素,溶解后,置365nm紫外光下直接照射20min,距離5cm,加等體積TE,移入用TE平衡的Sephadex G—50 柱(高1.0cm),離心法過柱,收集液體即為Bio –DNA探針。
此法是在亞硫酸鹽催化下,生物素酰肼可置換寡核苷酸探針中胞嘧啶上的氨基,使生物素結(jié)合到DNA分子上而制成生物素化DNA探針。此法優(yōu)點(diǎn)是采用通用試劑和技術(shù),檢出敏感。Vicied 等人指出DNA和RNA中胞嘧啶N-4位置在亞硫酸氫鹽存在下可用乙二胺連接臂修飾,此過程也可能介導(dǎo)C-6位的磺酸鹽組分。在合適的條件下,可有3%~4%的堿基被修飾。新鮮配制亞硫酸氫鈉-乙二胺混合液,兩者混合液含量分別為1mol/L和3mol/l (pH6.0),加入對苯二酚,使終濃度為1mg/ml。將DNA用超聲打成500~800bp長度的片段,煮沸法變性,取1份DNA與9份上述混合液混合,42℃水浴3.5h。用5mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH8.5)在40℃下充分透析,濃縮DNA,再溶于200μl 0.1mol/L磷酸鈉緩沖液(pH8.5),再加入4mmol/L生物素-ε-氨基乙酸-N-羥基琥珀酰亞胺脂,室溫反應(yīng)2h,用含150mmol/l NaCl、1mmol/l EDTA的10mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.0)在40℃下充分透析,純化,-20℃保存。
取HBV質(zhì)粒DNA0.5μg,DNase I(SABC)2pg, 10×NBTμl,三蒸水補(bǔ)足體積至10μl,37℃,15min;加5mmol/l dATP dGTP dCTP Bio –11- dUTP各2μl,10×NBt 4μl,三蒸水補(bǔ)足體積至10μl,37℃,15min;三蒸水補(bǔ)足體積至49μl,DNA聚合酶i 5u,混勻,14℃過夜,加0.5mmol/l ED-TA(Ph8.0)1μl終止反應(yīng)。
已標(biāo)記探針的提純:10mg/ml tRNA 2μl,10mmol/L Tris –HCl (pH7.5)150μl,2.5倍體積的95%乙醇,置液氮中15min或-20℃過夜。15000r/min,離心10min,真空干燥后,溶于適量三蒸水中,即為純化的探針,-20℃?zhèn)溆谩?/p>
使用閉環(huán)或線性雙鏈質(zhì)粒DNA,或分離的雙鏈DNA片段均可進(jìn)行此法標(biāo)記,全質(zhì)粒標(biāo)記敏感性較高,因?yàn)闃?biāo)記物可同時(shí)摻入載體DNA。
此法也可用于放射性同位素和地辛標(biāo)記DNA法。
以HBV DNA為例。取HBv DNA質(zhì)粒0.5μg,隨機(jī)引物(Pharmacia)2μg,用TE(pH8.0)補(bǔ)足體積至10μl;100℃,熱變性5min,驟冷10min。加10×緩沖液(500mmol/l Tris –HCl (Ph6.6),100mmol/L MgCl2,10mmol/L β巰基乙醇),BSa 500μg/ml 5μl,5mmol/l dATP/dGTP dCTP各1μl,按不同比例加入Bio –11-Dutp,和dTTP,用三蒸水補(bǔ)足體積至48μl,加DNA聚合酶(SABC)8u,混勻,37℃,2h,加0.5mol/l EDTA(Ph8.0)2μl,終止反應(yīng)。
在隨機(jī)引物標(biāo)記體系中,加入不同梯度濃度比值的Bio-11-dUTP/dTTP(%),發(fā)現(xiàn)二者比值明顯影響探針標(biāo)記率和顯色靈敏度。Bio-11-Dutp/dTTP(%)比值為35%時(shí),其標(biāo)記率最高,顯色靈敏度達(dá)0.2pg,雜交靈敏度為1~2pg。二步法缺口平移標(biāo)記HBv DNA探針,其靈敏度低于隨機(jī)引物標(biāo)記。Mackeg等(Focus,1992;14:21)證實(shí)了用隨機(jī)引物標(biāo)記探針具有放大的效應(yīng)。隨機(jī)引物中加入一定比例的dTTP,能增加HBv DNA探針的標(biāo)記率和靈敏度。其靈敏度接近同位素標(biāo)記探針的靈敏度。
1988年德國Boehringer Manheims公司推出了一種地高辛標(biāo)記DNA檢測試劑盒。先將地高辛甙元通過一手臂聯(lián)接至dUTP上,用隨機(jī)引物法標(biāo)記DNA制成探針。平均每20~25個(gè)核苷酸中標(biāo)記一個(gè)地高辛甙元,然后用抗地高辛抗體的Fab片段與堿性磷酸酶的復(fù)合物和NBt – BCIP底物顯色檢測,靈敏度達(dá)0.1pg DNA,因此可做1μg哺乳動物DNA中單拷貝基因分析。此種探針有高度的靈敏性和特異性,安全穩(wěn)定,操作簡便,可避免內(nèi)源性干擾,是一種很有推廣價(jià)值的非放射性標(biāo)記探針。
標(biāo)記方法步驟:(1)取一小離心管(0.5ml)插入冰浴中,加入待標(biāo)記DNa 1μg/5μl,95℃變性10min,迅速移入鹽冰中3min。加入六核苷酸引物2μl,Dig-dNTP標(biāo)記物2μl和消毒雙蒸水10μl、大腸桿菌DNA聚合酶i Klenow片段1μl(單位)。(2)短時(shí)離心,37℃孵育至少60min(20h以內(nèi))。(3)加入2μl 0.2mol/L EDTA溶液中止反應(yīng)。再加入2.5μl 4mol/L LiCl和75μl預(yù)冷的乙醇(-20℃),放入-70℃至少30min或-20℃過夜。(4)離心(12000g)10min,棄上清,再加入70%乙醇(冷)40μl洗一次,離心,抽干,再溶于50μl TE溶液(pH8.0)中,分裝,-20℃存放備用。
光敏DNP由一連接臂組成,一端是2,4-二硝基苯,另一端有芳基疊氮化合物。此法適用于含氨基檢測基團(tuán)。其敏感性和光敏生物素標(biāo)記探針相同,檢測時(shí)需要抗DNP抗體和免疫化學(xué)顯色。標(biāo)記方法:(1)DNA不心變性,必須溶于水中,取2~10μg10μl,加入二甲亞砜25μl,每微克DNA加入光敏DNp 2μg(在避光條件下),混勻。(2)置入冰浴中,在特制燈10cm下照射10min。(3)加入水165μl,4mol/L醋酸鈉20μl和異丙醇50μl,混勻。(4)用705和無水乙醇沉淀各一次,晾干,按50μg/ml溶于200μl水中,如探針不溶時(shí),可在60℃水溶中加熱10min,離心5min,除去不溶性雜質(zhì),分裝,-20℃可保存1~2年。此法簡便,不僅適用于核酸標(biāo)記,也適用于蛋白質(zhì)標(biāo)記。
在溫和的條件下,TNBS將核酸的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為N-甲氧基-5,6-二氫嘧啶-6-磺酸鹽衍生物,對胞嘧啶殘基進(jìn)行磺化修飾制成磺化半抗原探針。此法十分簡便,也可用于蛋白質(zhì)的標(biāo)記。標(biāo)記方法:取變性單鏈的DNA5μg,溶于0.02mol/L硼酸鈉緩沖液(pH8.6)中,加入TNBS5μg溶解,在室溫中反應(yīng)1h。移入冰浴中,加入無水乙醇和70%乙醇各洗1次,晾干,用50μl消毒雙蒸水溶解,分裝,-2quanxiangyun.cn/shouyi/0℃保存?zhèn)溆谩?/p>
RNA探針比cDNA探針的敏感性提高10倍以上,在許多優(yōu)點(diǎn)。它們是單鏈,不需變性,也沒有互補(bǔ)鏈的干擾,與靶基因雜交比DNA探針更穩(wěn)定。Bio-11-dUTP可通過Sp6、T3和T7RNA聚合酶摻入到RNA轉(zhuǎn)錄子中。標(biāo)記方法:其下列反應(yīng)體積為50μl:40mmol/l Tris HCl pH8.0、8mmol/l MgCl2、2mmol/L亞精胺、25mmol/l NaCl, 1mmol/L每一ATP、GTP、GTP,1mmol/L生物素Bio-11-Dutp,500ng模板,45u T3RNA聚合酶;旌希37℃反應(yīng)1h。加入10%SDS終止反應(yīng)。凝膠過濾分離標(biāo)記RNA探針。
此法標(biāo)記原理如下圖所示:
標(biāo)記的HRP部分催化底物化學(xué)發(fā)光反應(yīng):氨基苯二甲酰肼
氨基苯二甲酸
+N2+光→X-光片上感光10~20min顯定影。
光亮子在酚、萘及胺類等增強(qiáng)劑促進(jìn)下,而使光亮增強(qiáng)。
這種方法就是利用特殊的酶底物,氧化后把產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽芊懦,稱為化學(xué)發(fā)光。雜交后與探針結(jié)合的酶催化相應(yīng)的發(fā)光劑,經(jīng)增強(qiáng)劑將光能放大,在X光片上顯示雜交信號。此方法靈敏度與同位素標(biāo)記水平相當(dāng),簡便快速,安全,是一種特異性好的檢測手段,具有廣泛的應(yīng)用前景。
HBV-DNA的HRP標(biāo)記方法:質(zhì)粒中插入HBV全基因組DNA,長3.2kb,載體為PBR322質(zhì)粒,4.3kb。將質(zhì)粒DNA用三蒸水稀釋成10ng/μl,取20μl放入EP管,100℃變性5min,加入20u HRP標(biāo)記試劑,混勻,加入戊二醛20μl混勻,37℃10min,此時(shí)可立即使用,或放在冰浴中10~15min內(nèi)使用,或加入50%去離子甘油-20℃保存供分子雜交用,可存放6個(gè)月。
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或稱體外基因倍增技術(shù),它利用一對位于待擴(kuò)增的DNA序列兩端的取向相對的DNA引物,在DNA聚合酶的介導(dǎo)下,經(jīng)過多次變性,退火和延伸過程的重復(fù)性循環(huán),大量合成靶DNA序列。在標(biāo)記dNTP存在時(shí),經(jīng)PCR反應(yīng)產(chǎn)生的靶DNA片段均參入了標(biāo)記物,用此法標(biāo)記的探針標(biāo)記率高達(dá)97.4%。此法重復(fù)性好,簡便、快速、特異、不要求模板DNA的純度,可以大量制備。此法有普遍應(yīng)用價(jià)值。
標(biāo)記方法如下:待標(biāo)DNA模板1ng,50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl(pH8.4),2.5mmol/LMgCl2dATP、dCTP、dGTP各200μmol/l dTTP150μmol/Ll,Bio-11-dUTP 50μmol./L, 引物各1μmol/L,明膠200μg/ml,2u Taq DAN聚合酶,總反應(yīng)體積為100μl。混勻后,加石蠟油封頂,94℃和55℃各2min,72℃3min,經(jīng)25個(gè)循環(huán)后,可產(chǎn)生5~10μg標(biāo)記探針,需時(shí)僅4h。乙醇沉淀擴(kuò)增的產(chǎn)物后,溶于100μl TE中,分裝-20℃。