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實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:附錄二 原位雜交組織化學(xué)常用試劑及處理

一、雜交前準(zhǔn)備(一)DEPC水是經(jīng)DEPC處理過(guò)的滅菌蒸餾水。DEPC即二乙基焦碳酸酯(diethylprocarbonate),可滅活各種蛋白質(zhì),是RNA酶的強(qiáng)抑制劑。原位雜交在雜交及其以前的各步處理中,所有液體試劑都應(yīng)經(jīng)DEPC處理。方法是:取市售DEPc 1ml,加入1L待處理水(蒸餾水等)…

一、雜交前準(zhǔn)備

(一)DEPC水是經(jīng)DEPC處理過(guò)的滅菌蒸餾水。

DEPC即二乙基焦碳酸酯(diethylprocarbonate),可滅活各種蛋白質(zhì),是RNA酶的強(qiáng)抑制劑。原位雜交在雜交及其以前的各步處理中,所有液體試劑都應(yīng)經(jīng)DEPC處理。方法是:取市售DEPc 1ml,加入1L待處理水(蒸餾水等)中,經(jīng)猛烈振搖后,于室溫靜止數(shù)小時(shí),然后高壓滅菌,以除去降解DEPC(DEPC分解為CO2乙醇)。有些試劑可直接加入DEPC,終濃度一般為0.1%~0.4%,原則上在雜交及其以前的步驟中,所有液體試劑均需用DEPC處理,或用DEPC水配制,包括乙醇的稀釋。此外,接觸標(biāo)本以及標(biāo)本有關(guān)的空中的洗滌也需DEPC水洗滌。

注意:①DEPC是一種潛在的致癌物質(zhì),在操作中應(yīng)盡量在通風(fēng)的條件下進(jìn)行,并避免接觸皮膚。②含有Tris緩沖液的溶液中,不能加入DEPC。

(二)載玻片的處理

組織原位雜交,常在載玻片上進(jìn)行,故載玻片的洗滌至關(guān)重要,必須保持清潔,并且不能有任何核酸的污染。處理方法如下:

(1)先經(jīng)洗衣粉浸泡過(guò)夜,次日自來(lái)水沖洗后,泡酸數(shù)小時(shí)以上,取出后再用流水沖洗,雙蒸水沖洗2~3次,置160℃以上烤箱中燒烤4h以上,或經(jīng)15磅高壓滅菌20min。經(jīng)以上處理可清除載片上的核酸酶。

(2)HCl處理法

(三)硅化

【方法1】(1)將一扎新的蓋玻片散開,在通風(fēng)條件下于0.1mol/L的HCI中煮20min,等其冷卻后,倒掉鹽酸。

(2)用去離子水沉漂洗玻片,豎放在架子上自然干燥。

(3)硅化蓋玻片:通風(fēng)條件下,將單塊的蓋玻片在二甲二氯硅浣(dimethyldichorsilane,DMDC)液中浸幾下,豎入在架子上干燥。

(4)收集干燥的蓋玻片于一可耐熱的petri氏盤(或培養(yǎng)皿)中,用去離子水漂洗數(shù)次,徹底清洗。

(5)用鋁箔將裝有蓋玻片的培養(yǎng)皿包好,于180℃烘烤4h過(guò)夜。取出待冷至室溫后,即可進(jìn)行后續(xù)處理。

附:2%DMDC

配制:按比例兩者充分混勻,靜止待氣泡消失即可使用。

用途:硅化玻片(載片、蓋片均可)。

【方法2】將經(jīng)過(guò)洗凈的玻璃蓋片分散開放在一金屬網(wǎng)中,并將該網(wǎng)放入一接有真空泵的干燥器中。同時(shí),在干燥器中放一盛有約1m二甲二氯硅浣(dimethyldiorosilane,DMDC)的小燒杯。蓋好干燥器(確保密閉),抽真空約5min,然后讓空氣沖入。取出盛有蓋片的金屬網(wǎng)架,用錫箔紙包埋,于250℃以上烘烤4h以上,最好過(guò)夜。冷卻后備用。

本法可用于玻璃及塑料器皿的硅化。塑料器皿只能于60℃燒干。

【方法3】APES(氨丙基三乙氧基硅浣)法

【方法4】

(1)49ml氯仿與1mg二甲二氯硅浣(DMDC)配液;

(2)倒入每個(gè)擬硅化的試管或離心管中,浸泡5min后用乙醇或重蒸水沖洗;

(3)玻璃器皿使用前位于180℃以上烘烤2h以上,塑料器皿應(yīng)于60℃烘烤過(guò)夜。

注意:DMDC有毒且高度揮發(fā),應(yīng)于通風(fēng)環(huán)境操作并戴口罩、手套,避免接觸皮膚或吸入。

(四)載片的包被(粘貼)

1.沾附劑

(1)多聚賴氨酸(poly-L-Lycine,PLL)

儲(chǔ)備液(0~5%)

按上述劑量充分混合,即為濃度為5mg/ml(0.5%)的PLL液。常分裝成1ml的包裝,-20℃存放。該液為儲(chǔ)備液,可反復(fù)凍融,無(wú)明顯影響。用前充分混合。

工作液(0.01%):

充分混合,靜止待氣泡消失。

(2)明膠液

配法:先稱取明膠溶于500~800ml DEPC水中,加熱攪拌助溶,待明膠完全溶解以后,加入甲明礬溶解后即可使用。注意,包被玻片時(shí),明膠液溫度最好保持在60℃左右,效果最佳。方法同PLL包被玻片。

2.多聚賴氨酸包被玻片的制備方法(其它包被劑相同)

(1)將事先準(zhǔn)備好的經(jīng)160℃以上烘烤,并冷卻至室溫的玻片(載片或蓋片),在0.05%(也有用0.1%)的PLL液中上下浸蘸幾下,分散開豎放在架子上,于空氣中自然干燥,4℃?zhèn)溆。注意:①浸蘸時(shí),務(wù)必使整個(gè)玻片完全浸于液體中,否則,包被不完全會(huì)產(chǎn)生標(biāo)本脫落現(xiàn)象;②干燥過(guò)程中注意避免塵埃污染;③按上法處理的玻片通常可存放在一定時(shí)間(室溫1月以上,4℃更長(zhǎng)),但仍建議盡早使用。

(2)多聚賴氨酸1mg溶于10ml滅菌的去離子水或1mmol/L的Tris-HCl緩沖液中(pH7.0),將其涂布于玻片上,待干燥后即可使用。該法包被的玻片可用于細(xì)胞涂片和切片。

(3)將PLL工作液滴至蓋玻片上5μl/片,用另一蓋玻片以推血涂片方法推片,或用另一蓋玻片緊貼于其上,相互磨擦以使兩蓋玻片相對(duì)的一面涂布上PLL。該法制備的玻片,只有一面是包被有PLL,故制備時(shí),待其晾干后,應(yīng)作好記號(hào),然后保存后備用。

多聚賴氨酸可用于多種核酸雜交,方法簡(jiǎn)單,結(jié)果可靠,有許多其它方法不可比擬的優(yōu)點(diǎn)。配制好的液體可存放于4℃或室溫,但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)解聚而失效,故建議使用時(shí)盡量新鮮配制。

(4)Vectabond粘附劑

該試劑是Vector公司新近推出的一種新型粘附劑。它與其它粘附劑的主要區(qū)別是:一般的粘附劑是通過(guò)物理性覆蓋在玻片表面,天長(zhǎng)日久,可quanxiangyun.cn/rencai/能由于包被不完全或局部脫落而致切片等標(biāo)本易于脫落。而Vectabond試劑是通過(guò)化學(xué)性作用,改變玻璃表面的分子結(jié)構(gòu),使標(biāo)本貼附牢固,不易脫落,且保持時(shí)間長(zhǎng)久,耗量小,價(jià)格便宜,一個(gè)包裝7ml可配成350ml工作液使用。操作程序:

標(biāo)本(鋪片、切片等)→丙酮(5min)→Vectabond試劑工作液(5min)→dH2O(2×5min)→干燥(溫箱,數(shù)小時(shí)過(guò)夜)→用鋁箔包好,室溫備用。

注意:制備和保存過(guò)程中避免污染。

經(jīng)上述處理的載玻片一般可存放半年以上(4℃可更長(zhǎng))。

(五)硅魚精子DNA的制備

(1)在50ml滅菌聚乙烯管中加入1g鮭精DNA,加入15ml DEPC水使其浸泡5min至2h;

(2)加入2.5ml 2mol/L HCl,室溫放置,DNA形成白色沉淀,充分振搖至沉淀物相互纏繞在一起,用吸頭尖端使之形成一球團(tuán)狀(2~3min);

(3)加入5.0ml 2mol/L的NaOH。搖動(dòng)小管使DNA懸浮、溶解,將小管置50℃15min助溶;

(4)用DEPC水將混合物稀釋至175ml(總體積),充分混合,注意確保管內(nèi)已無(wú)顆粒狀;

(5)加入20ml/l 1mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.4);

(6)用2mol/L的HCl滴定至DNA溶解pH為7.0~7.5;

(7)用無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾液體,去除顆粒。260nm測(cè)定溶液的OD值,方法是:取20μl DNA液混合于980μl水中,混勻后測(cè)定,吸收值乘以50即為DNA濃度(μg/ml);

(8)制備好的DNA液儲(chǔ)于-20℃?zhèn)溆茫们叭〕鰞鋈诤笾蠓小?/p>

二、關(guān)于探針的標(biāo)記

(一)cRNA探針的同位素標(biāo)記

1.標(biāo)記液(轉(zhuǎn)錄標(biāo)記)

2.轉(zhuǎn)錄緩沖液

※:用地高辛或生物素標(biāo)記時(shí),用UTP替代。

3.標(biāo)記終止液

4.標(biāo)記探針?biāo)庖?/p>

先用dH2O懸浮探針,再加入后兩種試劑,輕輕振搖混合,于60℃條件下反應(yīng)。

5.探針?biāo)鈺r(shí)間

注:LO-探針初始長(zhǎng)度(kb)

Lf-探針的終長(zhǎng)度(kb)

K-0.11kb/min

6.探針?biāo)饨K止液

每次加入充分混合,臨用前配。

7.探針沉淀液

每次加入,充分混合,新鮮配制。

(二)寡聚核苷酸3’端標(biāo)記(cRNA探針)

1.標(biāo)記反應(yīng)液

2.終止液:0.2mol/L EDTA

3.探針沉淀液

(三)cRNA探針非同位素標(biāo)記(地高辛及生物素)

1.標(biāo)記液

△:生物素標(biāo)記時(shí)為10mmol/L的生物素-11-UTP

※:為檢測(cè)標(biāo)記率而加。

2.轉(zhuǎn)錄標(biāo)記終止液

(1)0.2mol/L EDTA:用于地高辛標(biāo)記法

(2)生物素標(biāo)記終止液:

(四)DNA探針標(biāo)記常用試劑的配制

(1)10 ×缺口平移緩沖液:200mmol/l Tris-HCl,pH7.4含50mmol/L MgCl2;100mmol/Lβ-巰基乙醇、1mg/ml BSA。

(2)缺口平移反應(yīng)終止液:200mmol/L NaCl;10mmol/l Tris-HCl,pH7.4;11mmol/L EDTA; 0.5% SDS。

(3)DNaseⅠ:干粉狀DNaseⅠ(2000~3000u/mg)溶于20mmol/l Tris-HCl, pH7.5中(1mg/ml),10μl分裝,-20℃保存一年。

(4)10×DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)緩沖液:500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L Mg-Cl2;10mmol/L DTT;0.5mgBSA。

(5)10×激酶緩沖液:500mmol/L Tris-HCl,pH7.4,50mmol/L MgCl2;20mmol/LDTT; 1.0mmol/L亞精胺。

(6)10×隨機(jī)引物標(biāo)記緩沖液;500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L MgCl2;10mmol/Lβ-巰基乙醇;500μg/ml BSA。

(7)1×加尾緩沖液:100mmol/L二甲胂化鉀,pH7.0,1mmol/l CoCl20.2mmol/L DTT。

(8)1mol/L MgCl2:MgCl247.60g溶于500ml水中,100ml分裝,高壓滅菌,室溫保存。

(9)0.25mol/L EDTA(Ph8.0):EDTA 52.02g溶于400ml水中,調(diào)pH至8.0,加水至500ml,100ml分裝,高壓滅菌,室溫保存。

(10)4mol/L醋酸鈉:取無(wú)水醋酸鈉82g溶于200ml水中,用醋酸調(diào)pH至6.5,加水至250ml,高壓滅菌,或0.45μm膜過(guò)濾,室溫保存。

(11)10% SDS:10g SDS(十二烷基硫酸鈉)溶于50ml水中,加水至100ml,分裝后室溫保存。

(12)20×SSC:取NaCl 175.3g;檸檬酸鈉88.2g;加水至1000ml,用10mol/l NaOH調(diào)pH至7.0;高壓滅菌,室溫保存。

(13)無(wú)菌水:100ml去離子水或雙蒸水,分裝,高壓滅菌,室溫保存,開瓶后僅限一周使用。

(14)10×激酶緩沖液:500mmol/L Tris-HCl,pH7.4;100mmol/L MgCl2;50mmol/lDTT;10mmol/L亞精胺(非必需)。

(15)T4多聚核苷酸激酶:10u/μl,保存在甘油中,-20℃。

(16)TE緩沖液(Tris/EDTA):Tris,10mmol/l pH7.4(0.5ml 2mol/L貯存液),1.0mmol/l ED-TA,pH8.0(20μl 0.5mol/L)貯存液,加水至100ml,室溫保存。

(17)2mol/L Tris-HCl pH7.4:Tris242.2g溶于850ml,加濃HCl 75ml ,邊加邊緩慢攪動(dòng),至pH7.4,于加水至1000ml。

(18)1mol/L DTT(二硫蘇糖醇):3.0g DTT溶于20ml水中,分裝,于-20℃貯存。

(19)0.5mol/L EDTA(乙二胺四乙酸二鈉鹽):在燒杯中先加入300ml水,加入93.5g EDTA-Na2·2H2O,充分混勻,加10mol/l NaOH調(diào)pH至8.0,加水至500ml。

(20)10mol/L NaOH:200g NaOH溶于450ml水中,混勻,再加水至500ml。

(21)5mol/L NaCl:292.25g NaCl,加水至1000ml。

(22)1mol/L HCl:加86.2ml濃鹽酸至913.8ml水中。

(23)1mol/L CaCl2:147g CaCl2:2H2O,溶于1000ml水中,高壓滅菌,室溫保存。

三、固定劑

進(jìn)行原位雜交的組織或細(xì)胞標(biāo)本常需經(jīng)固定處理。盡管許多化學(xué)物質(zhì)對(duì)組織/細(xì)胞有固定作用,但核酸原位雜交的理想固定液應(yīng)具備如下特點(diǎn):①能很好地保持組織細(xì)胞的狀態(tài);②對(duì)核酸無(wú)抽提、修飾及降解作用;③不改變被檢核酸分子在組織細(xì)胞內(nèi)的定位;④對(duì)核酸及探針的雜交過(guò)程無(wú)阻礙作用;⑤固定液本身對(duì)雜交信號(hào)無(wú)遮蔽、掩蓋作用,如不使本底增加等;⑥理化性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格低廉。

1.4%多聚甲醛(Paraformaldehyde,PFA)

配法:稱取40g PFA溶于裝有500ml DEPC水的玻璃容器(燒杯或燒瓶)中,持續(xù)加熱磁力攪拌至60~65℃,使成乳白色懸液。用1.0mol/L的NaOH值至7.0,使呈清亮狀(滴加),再加入約500ml 2×PBS,充分混勻(在冰浴或冷水浴中),可再檢測(cè)一下pH,過(guò)濾后定容至1000ml,室溫或4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

注意:①配制時(shí)應(yīng)在通風(fēng)條件下操作,并避免接觸皮膚和吸入(戴手套及口罩),因PFA有較強(qiáng)的固定作用及毒性,對(duì)粘膜及皮膚有固定及毒性,刺激作用;②加熱時(shí),溫度不宜過(guò)高,常為60~65℃,否則,PFA降解失效;③配制好的PFA雖可存放一定時(shí)間,但過(guò)久的液體,固定效果下降,建議盡早使用。

附:固定液用PBS的配制:

配法:按上述比例稱取試劑,溶于DEPC水(也可用蒸餾水加DEPC)500~800ml中,過(guò)濾后,加水定容至1000ml,高壓滅菌。通常配制成10×PBS的儲(chǔ)備液,2×PBS和1×www.med126.comPBS可用DEPC水稀釋獲得。

除用DEPC水配制PFA外,也有用滅菌蒸餾水或經(jīng)DEPC處理的0.01~0.1mol/L的PBS配制的,方法及注意事項(xiàng)同上。

4% PFA是目前原位雜交組織化學(xué)技術(shù)中最常用的固定液,它能較好地保持組織及細(xì)胞內(nèi)的RNA,同時(shí)對(duì)形態(tài)保持也較好。通常組織塊固定4~12h,載片固定時(shí)間在10~15min以內(nèi),RNA含量較為恒定。過(guò)度延長(zhǎng)固定時(shí)間會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)生物大分子的過(guò)度交聯(lián),影響探針的穿透力,降低雜交效率。

2.甲醛

①10%甲醛(Formaldehyde,FA)

量取二者充分混合而可。較適于檢測(cè)RNA的組織及細(xì)胞固定,也可用于新鮮冰片切片后固定。

②10%福爾馬林試劑:

較適于固定細(xì)胞。

③10%中性福爾馬林

市售甲醛 100ml

Na2HPO44g

NaH2PO46.5g

DEPC水 ~1000ml

常用于石蠟樣品切片的固定。

10%的甲醛由于有促進(jìn)DNA雙鏈分子交聯(lián)的作用,干擾DNA變性,故不適于DNA雜交。在組織或細(xì)胞原位雜交中,可通過(guò)使用含50%甲酰胺的雜交液使DNA變性解鏈而解決。這類固定液在DNA/RNA雜交中有較好的效果。

3.4%戊二醛效果較40%差。

4.0.1%戊二醛常用于固定組織,適于新鮮組織冰凍切片及石蠟切片的后固定,常用于檢測(cè)DNA的原位組織雜交方法。

5.乙醇/醋酸(或冰醋酸)將乙醇與醋酸按3:1的體積比充分混合即可。該液較適于固定細(xì)胞的原位雜交,尤其檢測(cè)DNA時(shí)。

乙醇/醋酸雖廣泛應(yīng)用于原位雜交中,但RNA保留較差,可本底很低,即背景染色淡。

6.甲醇/醋酸(3:1)用前按體積比3:1比例充分混合即可。

7.甲醇/丙酮(1:1)適于培養(yǎng)細(xì)胞的原位雜交技術(shù)。

8.4%多聚甲醇-0.5%~1%戊二醛溶液在pH7.4磷酸緩沖液中,用于免疫電鏡樣品固定。

四、LB培養(yǎng)基

(一)液體LB培養(yǎng)基(Luria-Bertani培養(yǎng)基)

配制:取一1000ml的燒杯,將事先稱取好的試劑加入杯內(nèi),加H2O約500~800ml攪拌使其溶解完全。用5N的NaOH調(diào)pH至7.0,加入H2O定容至1000ml。15磅高壓滅20min。

(二)瓊脂糖平板培養(yǎng)基

細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂(或瓊脂糖)15g

液體培養(yǎng)基(如LB)~1000ml

按濃度比例,將瓊脂加入液體培養(yǎng)基(如LB)中,稍加攪拌,用紗布或紙封好瓶口,15磅高壓滅菌20min。

五、小量質(zhì)粒提取主要液體

1.溶液Ⅰ

2.溶液Ⅱ

3.溶液Ⅲ(3mol/L醋酸鈉)

加熱溶解后,再用冰醋酸(約40ml)調(diào)pH至4.8,補(bǔ)足H2O至200ml。

六、雜交前處理

1.蛋白酶(Proteinawe K, Pro.K) 蛋白酶K主要用于雜交前標(biāo)本處理,其作用是使組織達(dá)到一定消化,利于檢測(cè)分子的穿透,從而提高檢測(cè)方法的敏感性,但各種組織在不同條件下消化程度不一,因此,具體應(yīng)用時(shí),應(yīng)根據(jù)組織種類、溫度確定反應(yīng)時(shí)間及酶的濃度。過(guò)度消化可使組織形態(tài)結(jié)構(gòu)遭到明顯破壞,核酸分子也會(huì)受到影響。通常是將其配成儲(chǔ)備液(1mg/ml),臨用前,再配成工作液(約0.025mg/ml)。配制方法:

精心稱藥,將二者充分混合后,分裝成小份,-20℃存放,用時(shí)再取出凍融,余者棄去。

(2)工作液(臨用前配):

取儲(chǔ)備液(1mg/ml)按1:40稀釋,充分混合,即得約含Pro.K為25mg/ml的工作液。

(3)關(guān)于P-K緩沖液的配制:

稱取上述試劑,充分混合即可。

②1mol/L 的Tris-HCl(pH8.0):

先將Tris于800ml ddH2O中溶解,用HCl將pH調(diào)至8.0,ddH2O定溶于1000ml,高壓滅菌,室溫備用即可。

③0.5mol/L的EDTA:

稱取EDTA溶于約600ml ddH2O中,常需60℃持續(xù)攪拌以助溶,滴加NaOH至pH接近8.0時(shí),EDTA才開始溶解。待完全溶解后,冷卻至室溫,NaOH調(diào)pH至8.0,ddH2O定溶至1000ml,高壓滅菌,室溫備用。

2.甘氨酸

(1)1mol/L甘氨酸:

稱取甘氨酸75g溶于ddH2O或DEPC水中,最后補(bǔ)足ddH2O定容至1000ml,高壓滅菌備用。該液為儲(chǔ)備液,-20℃儲(chǔ)存。

(2)甘氨酸工作液(0.1mol/L):

將二者按1:10比例稀釋,即得甘氨酸工作液。一般要求臨用前新鮮配制。

甘氨酸有終止蛋白酶K作用的作用,以防過(guò)度消化。

3.0.25%醋酸-0.25%醋酸酐

配制:按上述配方,先以少許DEPC水溶解NaCl,然后加入三乙醇胺及濃HCl。DEPC水定容至約1000ml(997.5ml),臨用前,一邊搖動(dòng)溶液一邊加入醋酸酐,充分混合。注意操作時(shí)避免濃HCl 濺出,最好在通風(fēng)條件下進(jìn)行。

生物體內(nèi)有些組織,如神經(jīng)組織中的蛋白質(zhì),對(duì)帶負(fù)電荷的核酸探針較易吸附。經(jīng)該液乙;幚砗,可使切片標(biāo)本表現(xiàn)帶上負(fù)電荷,有排斥帶負(fù)電的核酸探針,減少非特異吸附,降低反應(yīng)背景的作用。

4.RNA酶溶液

取RNA酶A溶解于100ml DEPC水中,分裝成小份(1ml,10mg/ml),-20℃儲(chǔ)存。

臨用前,取RNA酶A儲(chǔ)備液,用2×SSC溶解配成工作液(0.01mg/ml).

5.0.2%

取2ml Triton X-100加入998ml PBS中,充分振蕩使其充分混合。

七、雜交用液

1.SSC(Standard Saline Citrate, SSC)

通常配成10×,20×,50×的儲(chǔ)備液,如下:

配制:先稱取上述兩種試劑,溶于約800ml ddH2O中,滴加10N的NaOH,將pH值調(diào)至7.0,補(bǔ)足ddH2O至1000ml,加入終濃度為0.1%~0.2%的DEPC,分裝后高壓滅菌,可室溫保存。

該液主要用于配制予雜交液及雜交后的各種洗脫液,以保持一定的離子強(qiáng)度。此外,在用于雜交的濕盒內(nèi)也常用5×的SSC以保持一定濕度。

2.Denhardt’s液

通常配成10×,50×或100×的儲(chǔ)備液

配制:稱取上述試劑,溶于800ml左右滅菌ddH2O中,定容至1000ml后,過(guò)濾后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

該液用于配制雜交液及予雜交液等。

3.雜交液及予雜交液

※:臨用前加;△予雜交液不加

配制:先以去離子甲酰胺與SSC于室溫混合,加入硫酸葡聚糖于50℃促溶,依次加入其它成份。硫酸葡聚糖在室溫常需數(shù)小時(shí)才能完全溶解。有時(shí)需旋渦振蕩。定容后充分混合。根據(jù)使用方便可分裝(最好用鋁箔將瓶子包好)存于4℃,可達(dá)數(shù)月。注意,雜交緩沖液在使用前切忌污染。

變性被打斷的無(wú)關(guān)DNA(常為鮭精DNA或鯡精DNA)可在予雜交及雜交前加入。此外,有許多物質(zhì)如肝素、多聚腺甘酸、醋酸鈉等多種成份,可根據(jù)需要加入雜交液中,上述配方所列只是不可缺少的基本成份。

配制好的雜交液不宜反復(fù)凍融,否則易產(chǎn)生硫酸葡聚糖沉淀現(xiàn)象。使用前最好加熱至50℃,使其充分溶解后再加入探針分子。至于探針的濃度視實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⑻结橆愋图皹?biāo)記方法而異。通常RNA探針分子濃度為0.5~2μg/ml,DNA探針濃度為1μg/ml,此外,如使用35S標(biāo)記的探針,還需加入終濃度為100mmol/L的二硫蘇糖醇(Dithiothreitol,DTT)至雜交液及雜交后的洗脫液中。

八、雜交后漂洗溶液

無(wú)論用何種標(biāo)記方法及何種信號(hào)顯示方法,在雜交后洗脫則是大同小異。在此,歸納幾種帶有共同性及常用的洗脫液。

該液常用于雜交后的初次洗脫,故離子強(qiáng)度(張力)較高。

該液常用于雜交后的第二次洗脫,離子強(qiáng)度較低,經(jīng)過(guò)上述兩套洗脫液洗后,有的還可用2×SSC,10%(0.1%)SDS洗脫。

主要是洗去殘留的RNA,降低背景。用于以RNA為探針的原位雜交方法中。

4.Dig標(biāo)記探針雜交后處理液

用ddH2O溶液并定容至1000ml。

用ddH2O溶解并定容至1000ml。

配制同上。

左旋咪唑有消除內(nèi)源性磷酸酶的作用。

九、原位雜交信號(hào)顯示

目前應(yīng)用原位雜交方法中,信號(hào)的顯示主要有放射自顯影,酶底物及免疫金銀等方法,在此歸納有關(guān)的主要試劑。

1.A-B顯影液

稱取上述試劑,按配方分別溶于50ml ddH2O中,于顯影前,在室溫將兩者(A液及B液)按1:1混合,稍加搖動(dòng)促進(jìn)混合,即可將貼有切片標(biāo)本的切片放入顯影液,于室溫避光(可暗室)反應(yīng)5~15min。顯影時(shí)間和溫度相關(guān),需自己根據(jù)情況摸索。終止反應(yīng)只需將顯影液倒出,自來(lái)水沖洗即可。倒出的AB顯影液可暫時(shí)不扔,光鏡下觀察,若明顯顯影不夠,還可重新或繼續(xù)顯影。AB顯影液要求臨用前配制,在顯影時(shí)才將AB二液混合。否則,A液過(guò)久會(huì)產(chǎn)生黃色沉淀,增加背景。

AB液用于免疫金銀法中,使金標(biāo)記顆粒信號(hào)放大,形成棕黑色沉淀。

2.DAB-H2O顯色液

配制方法見附錄一。

該液用于標(biāo)本被標(biāo)記上辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的方法。產(chǎn)物為棕黃色。

3.NBT-BCIP顯色液

配制方法,詳見附錄一。

該液用于有堿性磷酸酶標(biāo)記物的方法中。產(chǎn)物為紫藍(lán)色。

4.Kodak D-19顯影液

配制:先將500ml水中加溫50℃,按上述配方順序加藥,同時(shí)充分?jǐn)嚢,每加一種藥完全溶解后,再加另一種藥品,否則,所配的顯影液易產(chǎn)生混濁而效果差,最后補(bǔ)足水至1000ml充分混合,室溫或4℃避光保存。最好包上紙。

該液用于放射自顯影時(shí)的顯影。

5.Kodak F-5定影液(酸性堅(jiān)膜定影液)

※:28%醋酸為3份冰醋酸和8份水混合液。

配制:同Kodak D-19顯影液。

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