實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:附錄二　原位雜交組織化學(xué)常用試劑及處理

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一、雜交前準(zhǔn)備（一）DEPC水是經(jīng)DEPC處理過(guò)的滅菌蒸餾水。DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可滅活各種蛋白質(zhì)，是RNA酶的強(qiáng)抑制劑。原位雜交在雜交及其以前的各步處理中，所有液體試劑都應(yīng)經(jīng)DEPC處理。方法是：取市售DEPc 1ml，加入1L待處理水（蒸餾水等）…

一、雜交前準(zhǔn)備

（一)DEPC水是經(jīng)DEPC處理過(guò)的滅菌蒸餾水。

DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate)，可滅活各種蛋白質(zhì)，是RNA酶的強(qiáng)抑制劑。原位雜交在雜交及其以前的各步處理中，所有液體試劑都應(yīng)經(jīng)DEPC處理。方法是：取市售DEPc 1ml，加入1L待處理水（蒸餾水等)中，經(jīng)猛烈振搖后，于室溫靜止數(shù)小時(shí)，然后高壓滅菌，以除去降解DEPC（DEPC分解為CO₂和乙醇)。有些試劑可直接加入DEPC，終濃度一般為0.1%～0.4%，原則上在雜交及其以前的步驟中，所有液體試劑均需用DEPC處理，或用DEPC水配制，包括乙醇的稀釋。此外，接觸標(biāo)本以及標(biāo)本有關(guān)的空中的洗滌也需DEPC水洗滌。

注意：①DEPC是一種潛在的致癌物質(zhì)，在操作中應(yīng)盡量在通風(fēng)的條件下進(jìn)行，并避免接觸皮膚。②含有Tris緩沖液的溶液中，不能加入DEPC。

（二)載玻片的處理

組織原位雜交，常在載玻片上進(jìn)行，故載玻片的洗滌至關(guān)重要，必須保持清潔，并且不能有任何核酸的污染。處理方法如下：

（1)先經(jīng)洗衣粉浸泡過(guò)夜，次日自來(lái)水沖洗后，泡酸數(shù)小時(shí)以上，取出后再用流水沖洗，雙蒸水沖洗2～3次，置160℃以上烤箱中燒烤4h以上，或經(jīng)15磅高壓滅菌20min。經(jīng)以上處理可清除載片上的核酸酶。

（2)HCl處理法

（三)硅化

【方法１】（1)將一扎新的蓋玻片散開(kāi)，在通風(fēng)條件下于0.1mol/L的HCI中煮20min,等其冷卻后,倒掉鹽酸。

（2)用去離子水沉漂洗玻片，豎放在架子上自然干燥。

（3)硅化蓋玻片：通風(fēng)條件下，將單塊的蓋玻片在二甲二氯硅浣（dimethyldichorsilane,DMDC)液中浸幾下，豎入在架子上干燥。

（4)收集干燥的蓋玻片于一可耐熱的petri氏盤（或培養(yǎng)皿)中，用去離子水漂洗數(shù)次，徹底清洗。

（5)用鋁箔將裝有蓋玻片的培養(yǎng)皿包好，于180℃烘烤4h過(guò)夜。取出待冷至室溫后，即可進(jìn)行后續(xù)處理。

附：2%DMDC

配制：按比例兩者充分混勻，靜止待氣泡消失即可使用。

用途：硅化玻片（載片、蓋片均可)。

【方法2】將經(jīng)過(guò)洗凈的玻璃蓋片分散開(kāi)放在一金屬網(wǎng)中，并將該網(wǎng)放入一接有真空泵的干燥器中。同時(shí)，在干燥器中放一盛有約1m二甲二氯硅浣（dimethyldiorosilane,DMDC)的小燒杯。蓋好干燥器（確保密閉)，抽真空約5min，然后讓空氣沖入。取出盛有蓋片的金屬網(wǎng)架，用錫箔紙包埋，于250℃以上烘烤4h以上，最好過(guò)夜。冷卻后備用。

本法可用于玻璃及塑料器皿的硅化。塑料器皿只能于60℃燒干。

【方法3】APES（氨丙基三乙氧基硅浣)法

【方法4】

（1)49ml氯仿與1mg二甲二氯硅浣（DMDC)配液；

（2)倒入每個(gè)擬硅化的試管或離心管中，浸泡5min后用乙醇或重蒸水沖洗；

（3)玻璃器皿使用前位于180℃以上烘烤2h以上，塑料器皿應(yīng)于60℃烘烤過(guò)夜。

注意：DMDC有毒且高度揮發(fā)，應(yīng)于通風(fēng)環(huán)境操作并戴口罩、手套，避免接觸皮膚或吸入。

（四)載片的包被（粘貼)

１．沾附劑

（1)多聚賴氨酸(poly-L-Lycine,PLL)

儲(chǔ)備液（0～5%)

按上述劑量充分混合，即為濃度為5mg/ml(0.5%)的PLL液。常分裝成1ml的包裝，-20℃存放。該液為儲(chǔ)備液，可反復(fù)凍融，無(wú)明顯影響。用前充分混合。

工作液（0.01%)：

充分混合，靜止待氣泡消失。

（2)明膠液

配法：先稱取明膠溶于500～800ml DEPC水中，加熱攪拌助溶，待明膠完全溶解以后，加入甲明礬溶解后即可使用。注意，包被玻片時(shí)，明膠液溫度最好保持在60℃左右，效果最佳。方法同PLL包被玻片。

2．多聚賴氨酸包被玻片的制備方法（其它包被劑相同)

（1)將事先準(zhǔn)備好的經(jīng)160℃以上烘烤，并冷卻至室溫的玻片（載片或蓋片)，在0.05%（也有用0.1%)的PLL液中上下浸蘸幾下，分散開(kāi)豎放在架子上，于空氣中自然干燥，4℃?zhèn)溆�。注意：①浸蘸時(shí)，務(wù)必使整個(gè)玻片完全浸于液體中，否則，包被不完全會(huì)產(chǎn)生標(biāo)本脫落現(xiàn)象；②干燥過(guò)程中注意避免塵埃污染；③按上法處理的玻片通�？纱娣旁谝欢〞r(shí)間（室溫1月以上，4℃更長(zhǎng))，但仍建議盡早使用。

（2)多聚賴氨酸1mg溶于10ml滅菌的去離子水或1mmol/L的Tris-HCl緩沖液中（pH7.0)，將其涂布于玻片上，待干燥后即可使用。該法包被的玻片可用于細(xì)胞涂片和切片。

（3)將PLL工作液滴至蓋玻片上5μl/片，用另一蓋玻片以推血涂片方法推片，或用另一蓋玻片緊貼于其上，相互磨擦以使兩蓋玻片相對(duì)的一面涂布上PLL。該法制備的玻片，只有一面是包被有PLL，故制備時(shí)，待其晾干后，應(yīng)作好記號(hào)，然后保存后備用。

多聚賴氨酸可用于多種核酸雜交，方法簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠，有許多其它方法不可比擬的優(yōu)點(diǎn)。配制好的液體可存放于4℃或室溫，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)解聚而失效，故建議使用時(shí)盡量新鮮配制。

（4)Vectabond粘附劑

該試劑是Vector公司新近推出的一種新型粘附劑。它與其它粘附劑的主要區(qū)別是：一般的粘附劑是通過(guò)物理性覆蓋在玻片表面，天長(zhǎng)日久，可quanxiangyun.cn/rencai/能由于包被不完全或局部脫落而致切片等標(biāo)本易于脫落。而Vectabond試劑是通過(guò)化學(xué)性作用，改變玻璃表面的分子結(jié)構(gòu)，使標(biāo)本貼附牢固，不易脫落，且保持時(shí)間長(zhǎng)久，耗量小，價(jià)格便宜，一個(gè)包裝7ml可配成350ml工作液使用。操作程序：

標(biāo)本（鋪片、切片等)→丙酮（5min)→Vectabond試劑工作液（5min)→dH₂O(2×5min)→干燥（溫箱，數(shù)小時(shí)過(guò)夜)→用鋁箔包好，室溫備用。

注意：制備和保存過(guò)程中避免污染。

經(jīng)上述處理的載玻片一般可存放半年以上（4℃可更長(zhǎng))。

（五)硅魚(yú)精子DNA的制備

（1)在50ml滅菌聚乙烯管中加入1g鮭精DNA，加入15ml DEPC水使其浸泡5min至2h；

（2)加入2.5ml 2mol/L HCl，室溫放置，DNA形成白色沉淀，充分振搖至沉淀物相互纏繞在一起，用吸頭尖端使之形成一球團(tuán)狀（2～3min)；

（3)加入5.0ml 2mol/L的NaOH。搖動(dòng)小管使DNA懸浮、溶解，將小管置50℃15min助溶；

（4)用DEPC水將混合物稀釋至175ml（總體積)，充分混合，注意確保管內(nèi)已無(wú)顆粒狀；

（5)加入20ml/l 1mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH7.4)；

（6)用2mol/L的HCl滴定至DNA溶解pH為7.0～7.5；

（7)用無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾液體，去除顆粒。260nm測(cè)定溶液的OD值，方法是：取20μl DNA液混合于980μl水中，混勻后測(cè)定，吸收值乘以50即為DNA濃度（μg/ml)；

（8)制備好的DNA液儲(chǔ)于-20℃?zhèn)溆茫们叭〕鰞鋈诤笾蠓小?/p>

二、關(guān)于探針的標(biāo)記

（一)cRNA探針的同位素標(biāo)記

1．標(biāo)記液（轉(zhuǎn)錄標(biāo)記)

2．轉(zhuǎn)錄緩沖液

※：用地高辛或生物素標(biāo)記時(shí)，用UTP替代。

3．標(biāo)記終止液

4．標(biāo)記探針?biāo)庖?/p>

先用dH₂O懸浮探針，再加入后兩種試劑，輕輕振搖混合，于60℃條件下反應(yīng)。

5．探針?biāo)鈺r(shí)間

注：L_O－探針初始長(zhǎng)度（kb)

L_f－探針的終長(zhǎng)度（kb)

K－0.11kb/min

6．探針?biāo)饨K止液

每次加入充分混合，臨用前配。

7．探針沉淀液

每次加入，充分混合，新鮮配制。

（二)寡聚核苷酸3’端標(biāo)記（cRNA探針)

1．標(biāo)記反應(yīng)液

2．終止液：0.2mol/L EDTA

3.探針沉淀液

（三)cRNA探針?lè)峭凰貥?biāo)記（地高辛及生物素)

1．標(biāo)記液

△：生物素標(biāo)記時(shí)為10mmol/L的生物素-11-UTP

※：為檢測(cè)標(biāo)記率而加。

2．轉(zhuǎn)錄標(biāo)記終止液

（1)0.2mol/L EDTA：用于地高辛標(biāo)記法

（2)生物素標(biāo)記終止液：

（四)DNA探針標(biāo)記常用試劑的配制

（1)10 ×缺口平移緩沖液：200mmol/l Tris-HCl,pH7.4含50mmol/L MgCl₂;100mmol/Lβ-巰基乙醇、1mg/ml BSA。

（2)缺口平移反應(yīng)終止液：200mmol/L NaCl;10mmol/l Tris-HCl,pH7.4;11mmol/L EDTA; 0.5% SDS。

（3)DNaseⅠ:干粉狀DNaseⅠ(2000～3000u/mg)溶于20mmol/l Tris-HCl, pH7.5中（1mg/ml),10μl分裝，-20℃保存一年。

（4)10×DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段)緩沖液：500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L Mg－Cl₂;10mmol/L DTT;0.5mgBSA。

（5)10×激酶緩沖液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4,50mmol/L MgCl₂;20mmol/LDTT; 1.0mmol/L亞精胺。

（6)10×隨機(jī)引物標(biāo)記緩沖液；500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L MgCl₂;10mmol/Lβ-巰基乙醇；500μg/ml BSA。

（7)1×加尾緩沖液：100mmol/L二甲胂化鉀，pH7.0,1mmol/l CoCl₂0.2mmol/L DTT。

（8)1mol/L MgCl₂:MgCl₂47.60g溶于500ml水中，100ml分裝，高壓滅菌，室溫保存。

（9)0.25mol/L EDTA(Ph8.0):EDTA 52.02g溶于400ml水中，調(diào)pH至8.0，加水至500ml，100ml分裝，高壓滅菌，室溫保存。

（10)4mol/L醋酸鈉：取無(wú)水醋酸鈉82g溶于200ml水中，用醋酸調(diào)pH至6.5，加水至250ml，高壓滅菌，或0.45μm膜過(guò)濾，室溫保存。

（11)10% SDS：10g SDS（十二烷基硫酸鈉)溶于50ml水中，加水至100ml，分裝后室溫保存。

（12)20×SSC：取NaCl 175.3g;檸檬酸鈉88.2g;加水至1000ml，用10mol/l NaOH調(diào)pH至7.0；高壓滅菌，室溫保存。

（13)無(wú)菌水：100ml去離子水或雙蒸水，分裝，高壓滅菌，室溫保存，開(kāi)瓶后僅限一周使用。

（14)10×激酶緩沖液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4;100mmol/L MgCl₂;50mmol/lDTT;10mmol/L亞精胺（非必需)。

（15)T₄多聚核苷酸激酶：10u/μl，保存在甘油中，-20℃。

（16)TE緩沖液（Tris/EDTA)：Tris,10mmol/l pH7.4(0.5ml 2mol/L貯存液)，1.0mmol/l ED－TA,pH8.0(20μl 0.5mol/L)貯存液，加水至100ml，室溫保存。

（17)2mol/L Tris-HCl pH7.4:Tris242.2g溶于850ml，加濃HCl 75ml ,邊加邊緩慢攪動(dòng)，至pH7.4,于加水至1000ml。

（18)1mol/L DTT(二硫蘇糖醇)：3.0g DTT溶于20ml水中，分裝，于-20℃貯存。

（19)0.5mol/L EDTA（乙二胺四乙酸二鈉鹽)：在燒杯中先加入300ml水，加入93.5g EDTA－Na₂·2H₂O,充分混勻，加10mol/l NaOH調(diào)pH至8.0,加水至500ml。

（20)10mol/L NaOH：200g NaOH溶于450ml水中，混勻，再加水至500ml。

（21)5mol/L NaCl：292.25g NaCl,加水至1000ml。

（22)1mol/L HCl：加86.2ml濃鹽酸至913.8ml水中。

（23)1mol/L CaCl₂：147g CaCl₂：2H₂O,溶于1000ml水中,高壓滅菌,室溫保存。

三、固定劑

進(jìn)行原位雜交的組織或細(xì)胞標(biāo)本常需經(jīng)固定處理。盡管許多化學(xué)物質(zhì)對(duì)組織/細(xì)胞有固定作用，但核酸原位雜交的理想固定液應(yīng)具備如下特點(diǎn)：①能很好地保持組織細(xì)胞的狀態(tài)；②對(duì)核酸無(wú)抽提、修飾及降解作用；③不改變被檢核酸分子在組織細(xì)胞內(nèi)的定位；④對(duì)核酸及探針的雜交過(guò)程無(wú)阻礙作用；⑤固定液本身對(duì)雜交信號(hào)無(wú)遮蔽、掩蓋作用，如不使本底增加等；⑥理化性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格低廉。

1．4%多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFA)

配法：稱取40g PFA溶于裝有500ml DEPC水的玻璃容器（燒杯或燒瓶)中，持續(xù)加熱磁力攪拌至60～65℃，使成乳白色懸液。用1.0mol/L的NaOH值至7.0，使呈清亮狀（滴加)，再加入約500ml 2×PBS^※，充分混勻（在冰浴或冷水浴中)，可再檢測(cè)一下pH，過(guò)濾后定容至1000ml，室溫或4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

注意：①配制時(shí)應(yīng)在通風(fēng)條件下操作，并避免接觸皮膚和吸入（戴手套及口罩)，因PFA有較強(qiáng)的固定作用及毒性，對(duì)粘膜及皮膚有固定及毒性，刺激作用；②加熱時(shí)，溫度不宜過(guò)高，常為60～65℃，否則，PFA降解失效；③配制好的PFA雖可存放一定時(shí)間，但過(guò)久的液體，固定效果下降，建議盡早使用。

附：固定液用PBS的配制：

配法：按上述比例稱取試劑，溶于DEPC水（也可用蒸餾水加DEPC)500～800ml中，過(guò)濾后，加水定容至1000ml，高壓滅菌。通常配制成10×PBS的儲(chǔ)備液，2×PBS和1×www.med126.comPBS可用DEPC水稀釋獲得。

除用DEPC水配制PFA外，也有用滅菌蒸餾水或經(jīng)DEPC處理的0.01～0.1mol/L的PBS配制的，方法及注意事項(xiàng)同上。

4% PFA是目前原位雜交組織化學(xué)技術(shù)中最常用的固定液，它能較好地保持組織及細(xì)胞內(nèi)的RNA，同時(shí)對(duì)形態(tài)保持也較好。通常組織塊固定4～12h，載片固定時(shí)間在10～15min以內(nèi)，RNA含量較為恒定。過(guò)度延長(zhǎng)固定時(shí)間會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)生物大分子的過(guò)度交聯(lián)，影響探針的穿透力，降低雜交效率。

2．甲醛

①10%甲醛（Formaldehyde,FA)

量取二者充分混合而可。較適于檢測(cè)RNA的組織及細(xì)胞固定，也可用于新鮮冰片切片后固定。

②10%福爾馬林試劑：

較適于固定細(xì)胞。

③10%中性福爾馬林

市售甲醛　100ml

Na₂HPO₄4g

NaH₂PO₄6.5g

DEPC水　～1000ml

常用于石蠟樣品切片的固定。

10%的甲醛由于有促進(jìn)DNA雙鏈分子交聯(lián)的作用，干擾DNA變性，故不適于DNA雜交。在組織或細(xì)胞原位雜交中，可通過(guò)使用含50%甲酰胺的雜交液使DNA變性解鏈而解決。這類固定液在DNA/RNA雜交中有較好的效果。

3．4%戊二醛效果較40%差。

4．0.1%戊二醛常用于固定組織，適于新鮮組織冰凍切片及石蠟切片的后固定，常用于檢測(cè)DNA的原位組織雜交方法。

5．乙醇/醋酸（或冰醋酸)將乙醇與醋酸按3：1的體積比充分混合即可。該液較適于固定細(xì)胞的原位雜交，尤其檢測(cè)DNA時(shí)。

乙醇/醋酸雖廣泛應(yīng)用于原位雜交中，但RNA保留較差，可本底很低，即背景染色淡。

6．甲醇/醋酸（3：1)用前按體積比3：1比例充分混合即可。

7．甲醇/丙酮（1：1)適于培養(yǎng)細(xì)胞的原位雜交技術(shù)。

8．4%多聚甲醇-0.5%～1%戊二醛溶液在pH7.4磷酸緩沖液中，用于免疫電鏡樣品固定。

四、LB培養(yǎng)基

（一)液體LB培養(yǎng)基（Luria-Bertani培養(yǎng)基)

配制：取一1000ml的燒杯，將事先稱取好的試劑加入杯內(nèi)，加H₂O約500～800ml攪拌使其溶解完全。用5N的NaOH調(diào)pH至7.0,加入H₂O定容至1000ml。15磅高壓滅20min。

（二)瓊脂糖平板培養(yǎng)基

細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂（或瓊脂糖)15g

液體培養(yǎng)基（如LB)～1000ml

按濃度比例，將瓊脂加入液體培養(yǎng)基（如LB)中，稍加攪拌，用紗布或紙封好瓶口，15磅高壓滅菌20min。

五、小量質(zhì)粒提取主要液體

1．溶液Ⅰ

2．溶液Ⅱ

3．溶液Ⅲ（3mol/L醋酸鈉)

加熱溶解后，再用冰醋酸（約40ml)調(diào)pH至4.8，補(bǔ)足H₂O至200ml。

六、雜交前處理

1．蛋白酶（Proteinawe K, Pro.K) 蛋白酶K主要用于雜交前標(biāo)本處理，其作用是使組織達(dá)到一定消化，利于檢測(cè)分子的穿透，從而提高檢測(cè)方法的敏感性，但各種組織在不同條件下消化程度不一，因此，具體應(yīng)用時(shí)，應(yīng)根據(jù)組織種類、溫度確定反應(yīng)時(shí)間及酶的濃度。過(guò)度消化可使組織形態(tài)結(jié)構(gòu)遭到明顯破壞，核酸分子也會(huì)受到影響。通常是將其配成儲(chǔ)備液（1mg/ml)，臨用前，再配成工作液（約0.025mg/ml)。配制方法：

精心稱藥，將二者充分混合后，分裝成小份，-20℃存放，用時(shí)再取出凍融，余者棄去。

（2)工作液（臨用前配)：

取儲(chǔ)備液（1mg/ml)按1：40稀釋，充分混合，即得約含Pro.K為25mg/ml的工作液。

（3)關(guān)于P-K緩沖液的配制：

稱取上述試劑，充分混合即可。

②1mol/L 的Tris-HCl(pH8.0)：

先將Tris于800ml ddH₂O中溶解，用HCl將pH調(diào)至8.0,ddH₂O定溶于1000ml，高壓滅菌，室溫備用即可。

③0.5mol/L的EDTA：

稱取EDTA溶于約600ml ddH₂O中，常需60℃持續(xù)攪拌以助溶，滴加NaOH至pH接近8.0時(shí)，EDTA才開(kāi)始溶解。待完全溶解后，冷卻至室溫，NaOH調(diào)pH至8.0,ddH₂O定溶至1000ml，高壓滅菌，室溫備用。

2．甘氨酸

（1)1mol/L甘氨酸：

稱取甘氨酸75g溶于ddH₂O或DEPC水中，最后補(bǔ)足ddH₂O定容至1000ml，高壓滅菌備用。該液為儲(chǔ)備液，-20℃儲(chǔ)存。

（2)甘氨酸工作液（0.1mol/L)：

將二者按1：10比例稀釋，即得甘氨酸工作液。一般要求臨用前新鮮配制。

甘氨酸有終止蛋白酶K作用的作用，以防過(guò)度消化。

3．0.25%醋酸-0.25%醋酸酐

配制：按上述配方，先以少許DEPC水溶解NaCl，然后加入三乙醇胺及濃HCl。DEPC水定容至約1000ml(997.5ml)，臨用前，一邊搖動(dòng)溶液一邊加入醋酸酐，充分混合。注意操作時(shí)避免濃HCl 濺出，最好在通風(fēng)條件下進(jìn)行。

生物體內(nèi)有些組織，如神經(jīng)組織中的蛋白質(zhì)，對(duì)帶負(fù)電荷的核酸探針較易吸附。經(jīng)該液乙�；幚砗�，可使切片標(biāo)本表現(xiàn)帶上負(fù)電荷，有排斥帶負(fù)電的核酸探針，減少非特異吸附，降低反應(yīng)背景的作用。

4．RNA酶溶液

取RNA酶A溶解于100ml DEPC水中，分裝成小份（1ml,10mg/ml)，-20℃儲(chǔ)存。

臨用前，取RNA酶A儲(chǔ)備液，用2×SSC溶解配成工作液（0.01mg/ml).

5.0.2%

取2ml Triton X-100加入998ml PBS中，充分振蕩使其充分混合。

七、雜交用液

1．SSC（Standard Saline Citrate, SSC)

通常配成10×，20×，50×的儲(chǔ)備液，如下：

配制：先稱取上述兩種試劑，溶于約800ml ddH₂O中，滴加10N的NaOH，將pH值調(diào)至7.0，補(bǔ)足ddH₂O至1000ml，加入終濃度為0.1%～0.2%的DEPC，分裝后高壓滅菌，可室溫保存。

該液主要用于配制予雜交液及雜交后的各種洗脫液，以保持一定的離子強(qiáng)度。此外，在用于雜交的濕盒內(nèi)也常用5×的SSC以保持一定濕度。

2．Denhardt’s液

通常配成10×，50×或100×的儲(chǔ)備液

配制：稱取上述試劑，溶于800ml左右滅菌ddH₂O中，定容至1000ml后，過(guò)濾后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

該液用于配制雜交液及予雜交液等。

3．雜交液及予雜交液

※：臨用前加；△予雜交液不加

配制：先以去離子甲酰胺與SSC于室溫混合，加入硫酸葡聚糖于50℃促溶，依次加入其它成份。硫酸葡聚糖在室溫常需數(shù)小時(shí)才能完全溶解。有時(shí)需旋渦振蕩。定容后充分混合。根據(jù)使用方便可分裝（最好用鋁箔將瓶子包好)存于4℃，可達(dá)數(shù)月。注意，雜交緩沖液在使用前切忌污染。

變性被打斷的無(wú)關(guān)DNA（常為鮭精DNA或鯡精DNA)可在予雜交及雜交前加入。此外，有許多物質(zhì)如肝素、多聚腺甘酸、醋酸鈉等多種成份，可根據(jù)需要加入雜交液中，上述配方所列只是不可缺少的基本成份。

配制好的雜交液不宜反復(fù)凍融，否則易產(chǎn)生硫酸葡聚糖沉淀現(xiàn)象。使用前最好加熱至50℃，使其充分溶解后再加入探針?lè)肿�。至于探針的濃度視�?shí)驗(yàn)?zāi)康�、探針類型及�?biāo)記方法而異。通常RNA探針?lè)肿訚舛葹?.5～2μg/ml，DNA探針濃度為1μg/ml,此外，如使用³⁵S標(biāo)記的探針，還需加入終濃度為100mmol/L的二硫蘇糖醇（Dithiothreitol,DTT)至雜交液及雜交后的洗脫液中。

八、雜交后漂洗溶液

無(wú)論用何種標(biāo)記方法及何種信號(hào)顯示方法，在雜交后洗脫則是大同小異。在此，歸納幾種帶有共同性及常用的洗脫液。

該液常用于雜交后的初次洗脫，故離子強(qiáng)度（張力)較高。

該液常用于雜交后的第二次洗脫，離子強(qiáng)度較低，經(jīng)過(guò)上述兩套洗脫液洗后，有的還可用2×SSC，10%（0.1%)SDS洗脫。

主要是洗去殘留的RNA，降低背景。用于以RNA為探針的原位雜交方法中。

4．Dig標(biāo)記探針雜交后處理液

用ddH₂O溶液并定容至1000ml。

用ddH₂O溶解并定容至1000ml。

配制同上。

左旋咪唑有消除內(nèi)源性磷酸酶的作用。

九、原位雜交信號(hào)顯示

目前應(yīng)用原位雜交方法中，信號(hào)的顯示主要有放射自顯影，酶底物及免疫金銀等方法，在此歸納有關(guān)的主要試劑。

1．A-B顯影液

稱取上述試劑，按配方分別溶于50ml ddH₂O中，于顯影前，在室溫將兩者（A液及B液)按1：1混合，稍加搖動(dòng)促進(jìn)混合，即可將貼有切片標(biāo)本的切片放入顯影液，于室溫避光（可暗室)反應(yīng)5～15min。顯影時(shí)間和溫度相關(guān)，需自己根據(jù)情況摸索。終止反應(yīng)只需將顯影液倒出，自來(lái)水沖洗即可。倒出的AB顯影液可暫時(shí)不扔，光鏡下觀察，若明顯顯影不夠，還可重新或繼續(xù)顯影。AB顯影液要求臨用前配制，在顯影時(shí)才將AB二液混合。否則，A液過(guò)久會(huì)產(chǎn)生黃色沉淀，增加背景。

AB液用于免疫金銀法中，使金標(biāo)記顆粒信號(hào)放大，形成棕黑色沉淀。

2．DAB-H₂O顯色液