實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:附錄一　免疫細(xì)胞化學(xué)常用試劑介紹

一、固定劑

大多數(shù)神經(jīng)激素、肽類物質(zhì)為水溶性，在用于免疫細(xì)胞化學(xué)研究之前，常需固定。但肽類和蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)性質(zhì)不同，因而對(duì)不同的固定方法或固定劑的反應(yīng)也不盡相同。某些固定劑甚至可同時(shí)破壞和/或保護(hù)同一抗原的不同抗原決定簇。因此，在進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)研究之前，很有必要了解所要研究的物質(zhì)（蛋白質(zhì)或肽類)的化學(xué)性質(zhì)，并根據(jù)需要來選擇適宜的固定劑（或固定方法)以及改進(jìn)固定條件。

目前，免疫細(xì)胞化學(xué)研究中常用的固定劑仍為醛類固定劑，其中以甲醛類和戊二醛最為常用。在此，簡要介紹幾種目前較為常用和推薦的固定劑，以供讀者選用。

1. 4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.3)

試劑：多聚甲醛40g

0.1mol/L磷酸緩沖液至1000ml

配制方法：稱取40g多聚甲醛，置于三角燒瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L磷酸緩沖液（Phosphate Buffer以下簡稱PB)，加熱至60℃左右，持續(xù)攪拌（或磁力攪拌)使粉末完全溶解，通常需滴加少許1n NaOH才能使溶液清亮，最后補(bǔ)足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混勻。

該固定劑較適于光鏡免疫細(xì)胞化學(xué)研究，最好是動(dòng)物經(jīng)灌注固定取材后，繼續(xù)浸泡固定2～24h。另外，該固定劑較為溫和，適于組織標(biāo)本的較長期保存。

2. 4%多聚甲醛-磷酸二氫鈉/氫氧化鈉

試劑：A液：多聚甲醛40g

蒸餾水400ml

B液：Na2HPO4·2H2O16.88g

蒸餾水300ml

C液：NaOH　3.86g

蒸餾水200m

配制方法：A液最好在500ml的三角燒瓶中配制（方法同前)，至多聚甲醛完全溶解后冷卻待用。注意，在溶解多聚甲醛時(shí)，要盡量避免吸入氣體或?yàn)R入眼內(nèi)。B液和C液配制好后，將B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1nNaOH或1N HCl 將pH調(diào)至7.2～7.4，最后，補(bǔ)充蒸餾水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

該固定劑適于光鏡和電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)研究，用于免疫電鏡時(shí)，最好加入少量新鮮配制的戊二醛，使其終濃度為0.5%～1%。該固定劑較溫和，適于組織的長期保存。組織標(biāo)本于該固定液中，4℃冰箱保存數(shù)月仍可獲得滿意的染色效果。

3． Bouin’s液及改良Bouin’s液

試劑：飽和苦味酸

40%甲醛　250ml

冰醋酸50ml

配制方法：先將飽苦味酸過濾，加入甲醛（有沉淀者禁用)，最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中備用。冰醋酸最好在臨用前加入。改良Bouin’s液即不加冰醋酸。

該固定液為組織學(xué)、病理學(xué)常用固定劑這一，對(duì)組織的穿透力較強(qiáng)，固定較好，結(jié)構(gòu)完整。但因偏酸（pH為3～3.5)，對(duì)抗原有一定損害，且組織收縮較明顯，故不適于組織標(biāo)本的長期保存。此外，操作時(shí)，應(yīng)避免吸入或與皮膚接觸。

4．Zamboni’s(Stefanini’s)液

試劑：多聚甲醛　20g

飽和苦味酸 150ml

Karasson-Schwlt’s PB　至1000ml

配制方法：稱取多聚甲醛20g，加入飽和苦味酸150ml，加熱至60℃左右，持續(xù)攪拌使充分溶解、過濾、冷卻后，加Karasson-Schwlt’s PB至1000ml充分混合（Karasson –Schwlt’s磷酸緩沖液的配制配制方法見后)。

該固定液適于電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)，對(duì)超微結(jié)構(gòu)的保存較純甲醛為優(yōu)，也適于光鏡免疫細(xì)胞化學(xué)研究，為實(shí)驗(yàn)室常用固定劑之一。我們?cè)趹?yīng)用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的飽和苦味酸，以增加其對(duì)組織的穿透力和固定效果，保存更多的組織抗原。固定時(shí)間為6～18h。

5．PLP液PLP液即過碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛固定液（Periodate-Lysine-paraform-alde－h(huán)yde fixative)

試劑：過碘酸鈉

賴氨酸鹽酸鹽（或鹽酸賴氨酸)：

多聚甲醛

蒸餾水

配制方法：

（1)貯存液A（0.1mol/L賴氨酸-0.5mol/l Na3PO4,pH7.4)：稱取賴氨酸鹽酸鹽1.827g溶于50ml蒸餾水中，得0.2mol/L的賴氨酸鹽酸鹽溶液，然后加入Na2HPO4至0.1mol/L，將pH調(diào)至7.4，補(bǔ)足0.1mol/L的PB至100ml，使賴氨酸濃度也為0.1mol/L,4℃冰箱保存，最好兩周內(nèi)使用。此溶液的滲透濃度為300mOs mmol/L/kg。

（2)貯存液B（8%多聚甲醛溶液)：稱8g多聚甲醛加入100ml蒸餾水中，配成8%多聚甲醛液（方法見前)。過濾后4℃冰箱保存。

（3)臨用前，以3份A液與1份B液混合，再加入結(jié)晶過碘酸鈉（NaIO4)，使NaIO4終濃度為2%。由于AB兩液混合，pH從約7.5降至6.2，故固定時(shí)不需再調(diào)pH值。固定時(shí)間為6～18h。

該固定劑較適于富含糖類的組織，對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。其機(jī)制是借助于過碘酸氧化組織中的糖類形成醛基，通過賴氨酸的雙價(jià)氨基與醛基結(jié)合，從而與糖形成交聯(lián)。由于組織抗原絕大多數(shù)都是由蛋白質(zhì)和糖兩部分構(gòu)成，抗原決定簇位于蛋白部分，故該固定劑有選擇性地使糖類固定，這樣既穩(wěn)定了抗原，又不影響其在組織中的位置關(guān)系。Mclean和Nakane等認(rèn)為，最佳的混合是：含0.01mol/L的過碘酸鹽、0.075mol/L的賴氨酸、2%的多聚甲醛及0.037mol/L的磷酸緩沖液。

6．Karnovsky’s液（pH7.3)

試劑：多聚甲醛　30g

25%戊二醛　80ml

0.1mol/L PB至1000ml

配制方法：先將多聚甲醛溶于0.1mol/L PB中，再加入戊二醛，最后加0.1mol/L的PB至1000ml，混勻。

該固定劑適于電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)，用該固定液在4℃短時(shí)固定，比在較低濃度的戊二醛中長時(shí)間固定能更好地保存組織的抗原性和細(xì)微結(jié)構(gòu)。固定時(shí)最好先灌注固定，接著浸泡固定10～30min，用緩沖液漂洗后即可樹酯包埋或經(jīng)蔗糖溶液后用于恒冷切片。

7．0.4% 對(duì)苯醌 （Parabenzoquinone)

試劑：對(duì)苯醌　4.0g

0．01mol/L PBS1　000ml

配制方法：稱取4.0g對(duì)苯溶于1000ml 0.01mol/L的PBS即可。

對(duì)苯醌對(duì)抗原具有較好的保護(hù)作用，但對(duì)超微結(jié)構(gòu)的保存有一定影響，故常與醛類固定劑混合使用。一般要求臨用前配制，且避免加熱助溶，因加熱或放置時(shí)間過長，固定液變?yōu)樽厣�至褐色，�?huì)使組織標(biāo)本背景增加，影響觀察。此外，對(duì)苯醌有劇毒，使用時(shí)避免吸入或與皮膚接觸。

8．PFG液（Parabenzoquinone-Formaldehyde-Glutaraldehydefixative, PFG)

試劑：對(duì)苯醌20g

多聚甲醛15g

25%戊二醛　40ml

0.1mol/L二甲酸鈉緩沖液至1000ml

配制方法：先以500ml左右的二甲酸鈉緩沖液溶解對(duì)苯醌及多聚甲醛，然后加入戊二醛，最后加入二甲酸鈉緩沖液至1000ml充分混合。

對(duì)苯醌與戊二醛及甲醛聯(lián)合應(yīng)用，即可阻止醛基對(duì)抗原的損害，又不影響超微結(jié)構(gòu)的保存，故適于多種類抗原的免疫細(xì)胞化學(xué)，尤其是免疫電鏡的研究。

9．碳二亞酰胺-戊二醛（ECD-G)液

試劑：0.05mol/L PB500ml

0.01mol/L PBS 500ml

Tris　約14g

濃HCl 少許

ECD　 10g

25%戊二醛3.5ml

配制方法：先以約500ml的PB與相同體積的PBS混合，加入Tris（使其終濃度為1.4%)溶解，以濃HCl調(diào)pH至7.0，再將事先稱取好的ECD和戊二醛加入混合液，振搖后計(jì)時(shí)，用pH計(jì)檢測(cè)，約2～3min時(shí)，pH降至6.6，再以1N的NaOH在4min內(nèi)調(diào)pH至7.0，此時(shí)，將該混合固定液加入盛有細(xì)胞（經(jīng)PBS漂洗過)的器皿中，在23℃固定7min后，以PBS洗去固定液，即可進(jìn)一步處理。

ECD即乙基-二甲基氨基丙基碳亞胺鹽酸鹽[1-ethyl-3(3-dimethyl-aminoprpyl)-carboi－imidehydrochloride]，簡稱乙基-CDI，常用于多肽類激素的固定，對(duì)酶等蛋白質(zhì)的固定也有良好效果。ECD單獨(dú)應(yīng)用時(shí)，邊緣固定效應(yīng)重，但與戊二醛、Tris及PB聯(lián)合應(yīng)用，效果明顯改善，細(xì)胞質(zhì)仍可滲透，利用細(xì)胞中抗原的定位，超微結(jié)構(gòu)保存較好。目前認(rèn)為是一種用于培養(yǎng)細(xì)胞電鏡水平免疫細(xì)胞化學(xué)研究的很好的固定劑。

10．四氧化鋨（鋨酸Osmic Acid, OsO4)

配制：將洗凈裝有OsO4的安瓿中加熱后，迅速投入裝有溶劑的棕色瓶中，使安瓿遇冷自破。也可用鉆石刀在安瓿上劃痕，洗凈后再放入瓶中，蓋好瓶塞，用力撞擊安瓿，待其破后加溶劑稀釋。為保證充分溶解，應(yīng)在用前幾天配制。

（1)2% OsO4水溶解：取OsO41g溶于重蒸水中。此液常作為儲(chǔ)備液，于冰箱中密封保存。

（2)1% OsO4-PB：

試劑：A、2.26%NaH2PO4·2H2O4.15ml

B2.52%8.5ml

C、5.4%　葡萄糖　5ml

D、OsO4　0.5g

配制方法：先分別配好A、B、C三種液體，取A液41.5ml與B液8.5ml混合，將pH調(diào)至7.3～7.4，取A－B混合液45ml再與5ml C液混合即為0.12mol/L PBG。

（3)1%OsO4/0.1mol/L二甲胂酸鈉緩沖液（pH7.2～7.4)：

試劑：2% OsO4水溶液　10ml

0.2mol/L二甲胂酸鈉緩沖液（pH7.2～7.4)10ml

配制方法：取2%OsO4儲(chǔ)備液10ml與等量0.2mol/L、pH7.2～7.4的二甲胂酸鈉緩沖液充分混合即可。

OsO4是電鏡研究所必需的試劑，常用于后固定。盡管OsO4主要為脂類固定劑，但也可與肽類及蛋白質(zhì)起作用，形成肽-蛋白質(zhì)或肽-脂交聯(lián)。過氧化物酶的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)OsO4處理后，電子密度增高，適于電鏡研究。但由于OsO4的反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)光及電子有較明顯的吸收能力，因此在免疫細(xì)胞化學(xué)染色前常需去除，去鋨在光鏡水平常用1%的高錳酸鉀，在電鏡水平則常用H2O2來處理。

以上介紹了目前免疫細(xì)胞化學(xué)中常用的一些固定液。關(guān)于固定液種類還很多，如70%～90%的酒精、丙酮、醋酸酒精（含0.1%～1%醋酸的70%～90%的酒精等)，這些溶液都能促使蛋白質(zhì)凝固。它們最初只是光學(xué)顯微鏡通用的固定液，但在免疫細(xì)胞化學(xué)上用其它方法不成功時(shí)，也可試用�？傊�，掌握一個(gè)原則，免疫細(xì)胞化學(xué)中，含重金屬的固定液禁用（但Zenker-Formalin可進(jìn)行短時(shí)的固定)。目前多數(shù)認(rèn)為，對(duì)生物標(biāo)本較好的固定措施是：用4℃的Karnovsky’s液灌注固定10～30min后，接著在pH7.3、0.1mol/L的二甲胂酸鈉緩沖液中漂洗過液，這種短時(shí)冷固定處理，有助于超微結(jié)構(gòu)和許多肽類抗原的保存。對(duì)其它較難保存的抗原可嘗試PFG、PLP及Zamboni’s液等混合固定液。

二、緩沖液

免疫細(xì)胞化學(xué)中應(yīng)用的緩沖液種類較多，即使是同種緩沖液，其濃度、pH、離子強(qiáng)度等也常常不同。在此介紹幾種最常用的緩沖液的配制。

1．0.2mol/L(pH7.4)磷酸鹽緩沖液（PhosphateBuffer, PB)

試劑： NaH2PO4·2H2O

Na2HPO4·12H2O

配制方法：配制時(shí)，常先配制0.2mol/L的 NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4，兩者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液（PB)，根據(jù)需要可配制不同濃度的PB和PBS。

（1)0.2mol/L的 Na2HPO4；稱取Na2HPO4.12H2o 31.2g(或 NaH2PO4·H2O 27.6g)加重蒸水至1000ml溶解。

（2)0.2mol/L的 Na2HPO4：稱取NaHPO4.·12H2o 71.632g（或 Na2HPO4·7H2O 53.6g或 Na2HPO4·2H2o 35.6g)加重蒸水至1000ml溶解。

（3)0.2mol/LpH7.4的PB的配制：取19ml 0.2mol/L的 NaH2PO4和81ml 0.2mol/L的 Na2HPO4·12H2O,充分混合即為0.2mol/L的PB（pH約為7.4～7.5)。若pH偏高或偏低，可通過改變二者的比例來加以調(diào)整，室溫保存即可。

2．0.01mol/L磷酸鹽緩沖生理鹽水（PhosphateBuffered Saline, PBS)

試劑：0.2mol/L PB　50ml

NaCl 　8.5～9g(約0.15mol/L)

重蒸水 至1000ml

配制方法：稱取NaCl 8.5～9g及0.2mol/L的PB 50ml，加入1000ml的容量瓶中，最后加重蒸水至1000ml，充分搖勻即可。若擬配制0.02mol/L的PBS，則PB量加倍即可，依此類推。

PB和PBS是免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)中最為常用的緩沖液，0.01mol/L的PBS主要用于漂洗組織標(biāo)本、稀釋血清等，其pH應(yīng)在7.25～7.35之間，否則需要調(diào)整。0.1mol/L的PB常用于配制固定液、蔗糖等。一般情況下，0.2mol/l PB的pH值稍高些，稀釋成0.01mol/L的PBS時(shí)，�？蛇_(dá)到要求的pH值，若需調(diào)整pH，通常也是調(diào)PB的pH。

3．Karasson –Schwlt’s磷酸鹽緩沖液

試劑： NaH2PO4·H2O3.31g

Na2HPO4·7H2O　33.77g

重蒸水 至1000ml

配制方法：同前

該緩沖液主要用于配制Zamboni’s固定液。

4．0.5mol/L pH7.6的Tris- HCl緩沖液。

試劑：Tris(三羥甲基氨基甲烷)60.57g

1N HCl　約420ml

重蒸水 至1000ml

配制方法：先以少量重蒸水（300～500ml)溶解Tris,加入HCl后，用1N的HCl或1N的NaOH將pH調(diào)至7.6，最后加重蒸水至1000ml。此液為儲(chǔ)備液，于4℃冰箱中保存。免疫細(xì)胞化學(xué)中常用的Tris-HCl緩沖液濃度為0.05mol/L，用時(shí)取儲(chǔ)備液稀釋10倍即可。

該液主要用于配制Tris緩沖生理鹽水（TBS)、DAB顯色液。

5．Tris緩沖生理鹽水（TrisBuffered,Saline,TBS)

試劑：0.5mol/L Tris-HCl緩沖液　100ml

NaCl　3.5～9g(0.15mol/L)

重蒸水至1000ml

配制：先以重蒸水少許溶解NaCl,再加Tris-HCl緩沖液，最后加重蒸水至1000ml，充分搖勻使Tris終濃度為0.05mol/L。

TBS主要用于漂洗標(biāo)本，常用于免疫酶技術(shù)中。

6．Tris-TBS(PBS)

試劑：Triton X-100　10ml(1%)或3ml(0.3%)

0.5mol/L Tris緩沖液（pH7.6)1000ml(50ml)或(0.2mol/L的PB)

NaCl8.5～9g

重蒸水　至1000ml

配制方法：先以重蒸水少許溶解NaCl后，加入Triton X-100及Tris緩沖液或（PB)，最后加重蒸水至1000ml，充分搖勻。

該液常用濃度為1%及0.3%，前者主要用于漂洗標(biāo)本，后者主要用于稀釋血清。

7．0.1mol/L（pH7.4)二甲胂酸緩沖液

試劑：0.2mol/L二甲胂酸鈉500ml

0.1N HCl28ml

蒸餾水　至1000ml

配制方法：先稱取二甲胂酸鈉（MW：214)42.8g,加蒸餾水至1000ml，使0.2mol/L的二甲胂酸鈉溶液；再取HCl 1.7ml加蒸餾水至1000ml ,配成0.1N，最后 取0.2mol/L二甲胂酸鈉溶液500ml及0.1n HCl 28ml混合，加蒸餾水至1000ml，即為0.1mol/L的二甲胂酸鈉緩沖液。

8．幾種常用的不同pH值緩沖液的配制表

（1)0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（pH5.7～8.0)

(2)0.05mol/L Tris-HCl緩沖液（pH7.19～9.10)

(3)0.2mol/L醋酸鹽緩沖液（pH3.6～5.6)

(4)0.1mol/L二甲胂酸鈉緩沖液（pH5.0～7.4)

注：HCI可由NCO3代替，配制成二甲胂酸鈉-HNO3緩沖液。

（5)0.2mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.2～10.7)

三、顯色液

免疫細(xì)胞化學(xué)中，由于抗原-抗體反應(yīng)所形成的復(fù)合物本身無色，無法直接觀察，因而需借助于某些化學(xué)基團(tuán)的呈色作用，使其得以顯示，以利于在顯微鏡下觀察。常用的顯色液有：

1．DAB（Diaminobenzidine)顯色液

DAB即3，3-二氨基苯聯(lián)胺

試劑：DAB（常用四鹽酸鹽)　50mg

0.05mol/L TB 　100ml

30% H2O2　30～40μl

配制方法：先以少量0.05mol/L(pH7.6)的TB溶解DAB，然后加入余量TB，充分搖勻，使DAB終濃度為0.05%,過濾后顯色前加入30%的H2O230～40μl，使其終濃度為0.01%。

DAB顯色液主要用于免疫過氧化物酶法（如酶標(biāo)法、PAP法等)，其終產(chǎn)物可直接在光鏡下觀察，也可經(jīng)OsO4處理后，增加反應(yīng)產(chǎn)物的電子密度，用于電鏡觀察。但有幾點(diǎn)需注意：DAB溶解要完全，否則未溶解的顆粒沉積于標(biāo)本上影響觀察；DAB濃度不易過高，否則顯色液呈棕色，增加背景染色，另外DAB有致癌作用，故操作時(shí)應(yīng)戴手套，盡量避免與皮膚接觸，用后及時(shí)徹底沖洗，接觸DAB的實(shí)驗(yàn)用品最好經(jīng)洗液浸泡24h后使用。

2．4-氯-1-萘酚（4-Cl-1-Naphthol)顯色液

配方1：4-Cl-1-萘酚100mg

純乙醇 10ml

0.05mol/L TB(pH7.6)190ml

30% H2O2 10μl(0.003%)

配制方法：先將4-Cl-1-萘酚溶解于乙醇中，然后加入Tb 19ml，用前加入30% H2O2使其終濃度為0.005%，切片顯色時(shí)間通常為5～20min。

配方2：4-Cl-1-萘酚

N-二甲基甲酰胺（DMF)

0.05mol/L TB(pH7.6)

30% H2O2

配制方法：先將4-Cl-1-萘酚加入DMF中，加熱溶解使呈乳白色，再加入TB，乳白色變?yōu)樾鯛�，�?.5℃加熱5min后加入H2O2，攪動(dòng)使絮狀消失，趁熱過濾，當(dāng)降至略低于50℃時(shí)才放入組織標(biāo)本（注意：溫度過高易損傷標(biāo)本，過低則易重新出現(xiàn)沉淀)。顯色時(shí)間通常為5min左右。

4-Cl-1-萘酚的終產(chǎn)物顯示藍(lán)色。

多數(shù)認(rèn)為最好去除白色沉淀（如上述)，但Larsson等認(rèn)為，白色沉淀可作為背景，使陽性部位更易觀察。由于酒精可溶解4-Cl-1-萘酚顯色的組織標(biāo)本，勿用酒精脫水。

3．3-氨基-9-乙基卡唑（3-amino-9-ethylcarbozole,AEC)顯色液

試劑：AEC　20mg

二甲基甲酰胺（DMF)2.5ml

0.05mol/L醋酸緩沖液（pH5.5)50ml

30%H2O225ml

配制方法：先將AEC溶于DMF中，再加入醋酸緩沖液充分混勻。臨顯色前，加入30%H2O2。切片顯色時(shí)間為5～20min。

該顯色液作用后，陽性部分呈深紅色，加以蘇木精或亮綠等作為背景染色，則效果更佳。由于終產(chǎn)物溶于酒精和水，故需用甘油封固。

4．TMB顯色液

試劑：TMB

HCl

亞硝基鐵氰化鉀

無水酒精

配制方法：

（1)醋酸鹽緩沖液：取1.0mol/L的HCl 190ml加入1.0mol/L的醋酸鈉400ml中混合，再加蒸餾水稀釋至1000ml，用醋酸或NaOH將pH調(diào)至3.3。

（2)A液：取上述緩沖液5ml，溶解100mg亞硝基鐵氰化鉀，加蒸餾水92.5ml混合。

（3)B液：稱取5mg TMB加入2.5ml無水酒精中，可加熱至37℃～40℃直到TMB完全溶解。

（4)孵育液：放入標(biāo)本前數(shù)秒，取2.5ml B液及97.5ml A溶于試管中充分混合。（液體在20min內(nèi)應(yīng)保持清亮的黃綠色，否則可能已有污染)。酶反應(yīng)時(shí)，加入終濃度為0.005%的H2O2。

（5)主要顯色步驟：組織標(biāo)本在蒸餾水（或PBS)中漂洗數(shù)次（每次約10～15min)后放入未加H2O2的孵育液中作用20min（19℃～30℃)，然后向孵育液中放入H2O2（每100ml孵育液中加0.3%的H2O2 1.0～5.0ml)繼續(xù)孵育液20min左右（19℃～23℃)，撈出標(biāo)本漂洗數(shù)次（共30min左右)。在0～4℃條件下可在漂洗液放置4h直至貼片、脫水，封片。也可在貼片前在1%的中性紅中負(fù)染2～3min，也可在1%派諾寧（pH3.3～3.5)中負(fù)染5min后貼片、脫水、封片。

TMB即四甲基聯(lián)苯胺（Tetrabenzidine)是一種脂溶性較強(qiáng)的基團(tuán)，因此容易進(jìn)入細(xì)胞與細(xì)胞器中的HRP反應(yīng)，且由于這種高度的脂溶性，使其易形成多聚體，在HRP活性部位產(chǎn)生粗大的、深蘭色沉淀物，這使得TMB成為組化實(shí)驗(yàn)中的一種很好的發(fā)色團(tuán)。同時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物的沉淀，使得HRP的活性部位更加暴露，利于酶氧化反應(yīng)進(jìn)行。TMB的反應(yīng)產(chǎn)物為深藍(lán)色，利于光鏡觀察，且反應(yīng)產(chǎn)物越聚越大，常超出單個(gè)細(xì)胞器的范圍（而DAB則被限制在其內(nèi))，故TMB反應(yīng)的檢測(cè)閾較低。由quanxiangyun.cn/rencai/于上述優(yōu)點(diǎn)，目前TMB常用于光鏡及超微結(jié)構(gòu)水平的HRP及HRP-WGA神經(jīng)投射的研究。需要注意的是：TMB顯色液中的A液和B液應(yīng)在2h內(nèi)新鮮配制。另外，TMB是一種較強(qiáng)的皮膚刺激劑，并有致癌的潛在可能，故使用時(shí)應(yīng)帶手套及在通風(fēng)條件下操作。

5．NBT顯色液

試劑A液：5%NBT：稱取0.5gNBT溶于10ml 70%的DMF（二甲基甲胺)內(nèi)，充分混合，常存于4℃，也可裝成小份，-20℃保存，用前復(fù)溫。

B液：5% BCIP：稱取BCIp 0.5g溶于10ml 100%的DMF內(nèi)，混勻。4℃或分裝存于-20℃，用前恢復(fù)至室溫。

C．顯色液：取A液40μl，加入到盛有10ml的0.1mol/lTris-HCl(pH9.5,鈐0.1mol/L NaCl、5mmol/LMgCl2)管內(nèi)，充分混勻；再加入B液40μl，輕輕混合即可。最好用前新鮮配制。

NBT即四唑氮藍(lán)（Nitro-Blue-Tetrazolium),MW=818,為深藍(lán)色無定形微溶物質(zhì)。BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)。當(dāng)二者存在時(shí)，在堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AP)作用下，NBT被還原形成顯微鏡下可見的藍(lán)色或紫色沉淀。

四、粘附劑

在免疫細(xì)胞化學(xué)工作中，由于標(biāo)本（如切片)的脫落常影響工作的質(zhì)量的速度，故粘附劑的選擇和使用就顯得較為重要。

1．鉻礬明膠液

試劑：鉻礬0.5g

明膠（Gelatine)　5g

H2O ~1000ml

方法：在1000ml的燒杯或燒瓶中，以500～800ml H2O加溫溶解明膠，待其完全溶解后，再加入鉻礬。注意溫度過高易使明膠燒糊，包被玻片時(shí)最好控制水溫在70℃。如有明顯殘?jiān)�，過濾后使用。

2．

試劑：40%甲醛2.5ml

明膠0.5g

蒸餾水　至100ml

配制方法：用少許蒸餾水（約80ml)加熱溶解明膠，待完全溶化后，加入甲醛，最后補(bǔ)充蒸餾水至100ml混勻即可。

3．多聚賴氨酸（Poly-L-Lycine,PLL)

試劑：多聚賴氧酸　 5g

蒸餾水 ~1000ml

配制方法：稱取PLL，溶于H2O，充分混合即可，此液濃度為0.5%，可適當(dāng)稀釋配成0.01～0.5%濃度。4℃保存，也可-20℃?zhèn)溆谩�PLL可反復(fù)冰凍，效果無明顯影響，工作液常再稀釋10～50倍。

4．Vectabond試劑該試劑是Vector公司新進(jìn)推出的一種新型玻片粘附劑。該試劑與一般的粘附劑不同，它是通過對(duì)玻璃表面起化學(xué)修飾作用，改變其表面的化學(xué)物理特性，使組織切片牢固地貼于玻璃片上，貼上后不易脫落，保留時(shí)間較久。一個(gè)試劑盒（7ml)可配成350ml工作液（用丙酮配)。處理載玻片前（事先酸處理)，用染色缸裝好各種液體，按下列程序進(jìn)行：

干凈載玻片→丙酮5min→Vectabond試劑工作液（7ml Vectabond+ 350ml丙酮)：將載玻片用鑷子夾住浸入Vectabond試劑1～2次→dH2O，2×5min→干燥（37℃過夜)→用鋁箔包好，室溫存放備用。

注意：避免污染（塵埃等)。

綜上述方法處理的載片一般可存放半年以上。

五、封固劑

1．甘油-TBS及甘油-PBS

配制方法：按比例將甘油和TBS（或PBS)充分混合后，置4℃，冰箱靜止；待氣泡排除后方可使用。

2．甘油-明膠（凍)

試劑：明膠 10g

甘油 　12ml

蒸餾水 100ml

香草酚 少許

配制方法：稱取1g明膠于溫?zé)幔�約40℃)的蒸餾水中，充分溶解后過濾，再加入12ml甘油混合均勻。少許香草酚是為了防腐。

3．液體石蠟液體石蠟因含雜質(zhì)少，很少引起非特異性熒光，故常用于熒光組化及免疫熒光法時(shí)標(biāo)本的封固。

4．DPX

試劑：Distrene 　10g

酸二丁　 5ml

二甲苯　35ml

DPX為中性封固劑，用于多種染色方法勻不易褪色，但組織收縮較明顯，故應(yīng)盡量使其為均勻的一薄層。DPX現(xiàn)有商品出售，可直接應(yīng)用。若感過于粘稠，也可加少量二甲苯稀釋后應(yīng)用。注意：二甲苯不可加得太多，二甲苯揮發(fā)后，片子上出現(xiàn)許多干燥的空泡，影響觀察，遇有這種情況，可用二甲苯浸泡掉蓋玻后重新封固。

六、酶消化液

1．0.1%胰蛋白酶

試劑：胰蛋白酶 　0.1gm

0.1%氯化鈣（pH7.8)　100ml

配制方法：先配制0.1%的CaCl2,用0.1mol/L的NaOH將其pH調(diào)至7.8，然后加入蛋白酶溶解之。用前將胰蛋白酶消化液在水浴中予熱至37℃（載有標(biāo)本的玻片也在TBS中予熱至同樣樣溫度)。該消化液時(shí)間約為5～30min。

2．0.4%胃蛋白酶

試劑：胃蛋白酶 　400mg

0.1N HCl 100ml

配制方法：同胰蛋白酶。消化時(shí)間在37℃約為30min。

3．0.06% Pronase

試劑：Pronase　0.06g

0.05mol/L TB(pH7.5) 　100ml

配制方法：同前。

在免疫細(xì)胞化學(xué)染色中，有時(shí)經(jīng)Formalin過度固定的標(biāo)本，常會(huì)產(chǎn)生過量的醛基，遮蓋抗原，影響一抗與抗原的結(jié)合。用蛋白酶溶液消化，可起到暴露抗原部分的作用。消化時(shí)間應(yīng)根據(jù)不同組織而異，總之，在保持組織形態(tài)不被破壞的前提下，宜盡量延長消化時(shí)間。以上三種酶消化液中，以第一種最為常用。

七、其它

1．蔗糖溶液免疫細(xì)胞化學(xué)中應(yīng)用的蔗精，常用濃度為5%～30%。一般光鏡研究，僅用20%蔗糖處理已足矣，若制備電鏡標(biāo)本，在冰凍前最好經(jīng)上行蔗糖（5%、10%、15%、20%及20%蔗糖-5%甘油等)處理，以確保其良好的細(xì)微結(jié)構(gòu)。

（1)20%蔗糖液：

試劑：蔗糖 20g

0.1mol/L PB(pH7.5) 至100ml

配制方法：先以少許0.1mol/L的PB溶解蔗糖，再加0.1mol/l PB至100ml充分混合，置4℃冰箱保存。

該液多用于純光鏡研究。標(biāo)本在剛放入濃度如此高的蔗糖液，常浮在上面，當(dāng)標(biāo)本沉到底部時(shí)即可。通常光鏡標(biāo)本浸泡在20%蔗糖液中過夜。都能達(dá)到要求。

（2)20%蔗糖-5%甘油：

試劑：蔗糖 20g

甘油 　5ml

0.1mol/L PB至100ml(約95ml)

配制方法：先用少許PB溶解蔗糖后，再加入甘油，充分混勻，最后補(bǔ)足PB至100ml，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

該液主要用于電鏡標(biāo)本的處理，常浸泡過夜（其它濃度的蔗糖中常分別為2h左右)。

蔗糖是一種廉價(jià)的防凍劑，兼有脫水的作用，它可減小標(biāo)本在冰凍切片時(shí)冰晶形成的數(shù)量和大小，應(yīng)用較為方便。若無試劑蔗糖（Sucrose)也可用普通蔗糖（Cane Sugar)。配制好的蔗糖溶液，放置時(shí)間超過一個(gè)月時(shí)，應(yīng)重新配制。

2．T riton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)免疫細(xì)胞化學(xué)中，Triton X-100常用濃度為1%和0.3%，但通常是先配制成30%的Triton X-100儲(chǔ)備液，臨用時(shí)稀釋至所需濃度。

30% Triton X-100的配制：

試劑：Triton X-100　28.2ml

0.1mol/L PBS(pH7.3)或0.05mol/l TBS(pH7.4)72.8ml

配制方法：取Triton X-100及PBS（或TBS)混合，置37℃～40℃水浴中2～3h，使其充分溶解混勻。用前取該儲(chǔ)備液稀釋至所需濃度。

Triton X-100是一種非離子型表面活性劑（或稱清潔劑)，分子量為646.86（C34H62O11)。它能溶解脂質(zhì)，以增加抗體對(duì)細(xì)胞膜的通透性。1%的Triton X-100常用于漂洗組織標(biāo)本，0.3%的Triton X-100則常用于稀釋血清，配制BSA等。

3．甲醇-H2O2液

試劑：純甲醇 　10ml

30% H2O2　 0.1ml

配制方法：吸取30%的H2O20.1ml，加入100ml純甲醇中，充分混勻即可，使H2O2終濃度為0.3%（也有的用0.03%、0.5%等)。

甲醇-H2O2處理組織標(biāo)本，具有封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性的作用，但其具體機(jī)制至今仍不詳。通常處理時(shí)間在室溫約為5～30min。注意，用H2O2處理標(biāo)本，對(duì)某些抗原的抗原性有影響，故建議在使用新的抗血清或抗原時(shí)，最好同時(shí)設(shè)立非處理對(duì)照組。

4．常用生理鹽液

常用生理鹽液的成分（g/1000ml)

配制方法：精確稱取各種藥品（如上表)，加入500ml重蒸水中，待完全溶解后，補(bǔ)足重蒸水至1000ml，充分混勻即可。

在免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，某些物質(zhì)不宜經(jīng)固定劑作用或經(jīng)固定劑作用后仍易丟失，而需浸泡在生理鹽液中。這些生理鹽液的成分與正常哺乳動(dòng)物血清的成分相似，能使組織離體后能處于盡量接近生理狀態(tài)時(shí)的環(huán)境。Glucose通常是在用前臨時(shí)加入。有的（如Kerbs液)在使用時(shí)通常需通入含CO2/O2為2.5～5%/97.5～95%的氣體。這些生理鹽液中的CO2和二碳酸鹽，主要起緩沖作用，Glucose主要是提供離體組織有限的代謝所需的能量。