四、免疫電鏡金—銀法染色技術(shù)
關(guān)于免疫金銀細(xì)胞化學(xué)的原理、試劑配制和光鏡顯示技術(shù)在本書(shū)第五章 已作了較詳盡的敘述。免疫金銀細(xì)胞化學(xué)技術(shù)說(shuō)可應(yīng)用于電鏡水平。一般用于包埋前染色。其主要操作步驟如下:
。1)組織固定振動(dòng)切片機(jī)切片10~30μm。
。2)人3%正常羊血清,含0.1%Triton X—100 的PBS孵育30min,以封閉非特異性結(jié)合部位
。3)1%硼氫化鈉的PBS孵育30min。
。4)一抗37℃,2h。
(5)PBS含0.1%BSA pH7.4 沖洗3min×3次。
(6)PBS含0.1%BSA pH8.2 沖洗3min×3次。
(7)人10~15nm金標(biāo)羊抗兔抗血清,工作濃度約1:10,37℃孵育45min。
。8)硝酸銀液物理顯影(詳見(jiàn)第五章 第六節(jié) )。
(9)在解剖顯微鏡下取免疫反應(yīng)陽(yáng)性部位,人1%鋨酸后固定20min,常規(guī)脫水,樹(shù)脂包埋。
(10)超薄切片機(jī)切0.1μm左右半薄切片,定位陽(yáng)性反應(yīng)部位,制超薄切片。如有暗視野微鏡則更有助于定位。在暗視野前景下,金銀粒呈金黃色閃光顆粒,即使微量金銀也可定位,微鏡則更有助于定位。在暗視野前景下,金銀粒呈金黃色閃光顆粒,即使微量金銀也可定位。
(11)鈾—鉛電鏡染色,電鏡觀察。
免疫金銀法敏感度高,金銀顆粒電子密度高,反差強(qiáng);應(yīng)用包埋前染色可先定位陽(yáng)性反應(yīng)部位再作電鏡超薄切片,獲得陽(yáng)性反應(yīng)機(jī)率高,特別適用于含微量抗原的部位,如突觸等。其不足是須經(jīng)暗室顯影,手續(xù)較煩雜,包埋前免疫染色易增加非特異性染色。另外,由于單個(gè)金粒周?chē)Y(jié)合的銀粒不是固定的,受多種因素影響。因此,電鏡免疫金粒染色法的金粒銀粒計(jì)算不適于做半定量觀察,誤差較大。