四、免疫電鏡金—銀法染色技術(shù)
關(guān)于免疫金銀細(xì)胞化學(xué)的原理、試劑配制和光鏡顯示技術(shù)在本書(shū)第五章 已作了較詳盡的敘述。免疫金銀細(xì)胞化學(xué)技術(shù)說(shuō)可應(yīng)用于電鏡水平。一般用于包埋前染色。其主要操作步驟如下：
�。�1)組織固定振動(dòng)切片機(jī)切片10～30μm。
�。�2)人3%正常羊血清，含0.1%Triton X—100 的PBS孵育30min，以封閉非特異性結(jié)合部位
�。�3)1%硼氫化鈉的PBS孵育30min。
�。�4)一抗37℃，2h。
（5)PBS含0.1%BSA pH7.4 沖洗3min×3次。
（6)PBS含0.1%BSA pH8.2 沖洗3min×3次。
（7)人10～15nm金標(biāo)羊抗兔抗血清，工作濃度約1：10，37℃孵育45min。
�。�8)硝酸銀液物理顯影（詳見(jiàn)第五章 第六節(jié) )。
（9)在解剖顯微鏡下取免疫反應(yīng)陽(yáng)性部位，人1%鋨酸后固定20min，常規(guī)脫水，樹(shù)脂包埋。
（10)超薄切片機(jī)切0.1μm左右半薄切片,定位陽(yáng)性反應(yīng)部位,制超薄切片。如有暗視野微鏡則更有助于定位。在暗視野前景下，金銀粒呈金黃色閃光顆粒，即使微量金銀也可定位，微鏡則更有助于定位。在暗視野前景下，金銀粒呈金黃色閃光顆粒，即使微量金銀也可定位。
（11)鈾—鉛電鏡染色，電鏡觀察。
免疫金銀法敏感度高，金銀顆粒電子密度高，反差強(qiáng)；應(yīng)用包埋前染色可先定位陽(yáng)性反應(yīng)部位再作電鏡超薄切片，獲得陽(yáng)性反應(yīng)機(jī)率高，特別適用于含微量抗原的部位，如突觸等。其不足是須經(jīng)暗室顯影，手續(xù)較煩雜，包埋前免疫染色易增加非特異性染色。另外，由于單個(gè)金粒周?chē)Y(jié)合的銀粒不是固定的，受多種因素影響。因此，電鏡免疫金粒染色法的金粒銀粒計(jì)算不適于做半定量觀察，誤差較大。
