金標(biāo)法是Faulk和Taylor(1971)提出的,并首先用于免疫電鏡。它是利用膠體金在堿性環(huán)境中帶有負(fù)電的性質(zhì),使其與抗體相吸附,從而將抗體標(biāo)記。當(dāng)用金標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng)時(shí),在光鏡水平膠金液呈現(xiàn)鮮艷的櫻紅色,不需加外進(jìn)行染色。在電鏡水平,金顆粒具有很高的電子密度,清晰可辨。因此,免疫電鏡膠體金標(biāo)記法近年來被成功地應(yīng)用于生物學(xué)的各個(gè)方面,并取得了要喜的進(jìn)展,解決了一些過去未能解決的問題,80年代以來似有取代免疫電鏡PAP技術(shù)的趨勢(shì)。膠體金標(biāo)記抗體技術(shù)在電鏡水平應(yīng)用有許多優(yōu)點(diǎn):首先,手續(xù)不如PAP法煩瑣,不需用H2O2等損傷微細(xì)結(jié)構(gòu)的處理步驟,對(duì)微細(xì)結(jié)構(gòu)的影響較少。其次,金顆粒具有很高的電子密度,在電鏡下金顆粒清晰可辨,易于與其他免疫產(chǎn)物相區(qū)別。因此,金標(biāo)法還可以和PAP法相結(jié)合進(jìn)行雙重或多重染色的超微結(jié)構(gòu)定位。另外,利用不同直徑的金顆粒標(biāo)記不同的抗體,是研究突觸小泡內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)共存的有力工具。由于抗原抗體反應(yīng)部位結(jié)合金顆粒數(shù)量的多少可進(jìn)行粗略的免疫細(xì)胞化學(xué)定量研究。金標(biāo)抗體還可加入培養(yǎng)液中,對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)行標(biāo)記定位。曾有報(bào)告用金標(biāo)記法于細(xì)胞內(nèi)骨架的研究獲滿意的效果。由于金具有強(qiáng)烈的繼發(fā)電子的能力,因此,不僅可以用于透射電鏡的超薄切片觀察,也可以用于掃描電鏡對(duì)細(xì)胞表面的抗原、受體進(jìn)行標(biāo)記定位觀察。金標(biāo)液無毒性,對(duì)人體無損傷。膠體金及膠體金標(biāo)記物的制備見第五章 第3節(jié) 。在原位分子雜交技術(shù)在電鏡水平的應(yīng)用中,膠體金的標(biāo)記術(shù)被科技工作者認(rèn)為是當(dāng)前最理想的標(biāo)記物(詳見第二十章 )。
一、電鏡水平的免疫金染色法
應(yīng)用于電鏡水平的免疫法,可分為包埋前染色和包埋后染色,由于包埋前染色對(duì)細(xì)胞膜的穿透性差,一般只用于細(xì)胞表面的抗原標(biāo)記,如需穿透細(xì)胞膜,則需輔以凍融法或加入Triton X—100、皂素等活性劑,后者會(huì)加重細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的破壞,因此,現(xiàn)較普遍采用包埋后染色,現(xiàn)分別介紹如下:
1.包埋后染色
。1)超薄切片厚50~70nm左右,載于200~300網(wǎng)孔的鎳網(wǎng)上。
。2)置1%H2O2內(nèi)10min至1h(視樹脂的硬度和切片的厚度而定),以去鋨酸和增進(jìn)樹脂穿透性,有利抗體進(jìn)入。如切片很薄或于低溫包埋時(shí),此步可省略。操作時(shí),滴入1%H2O2液1滴于蠟板上,將網(wǎng)的載片面輕浮于液滴上。對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)切片,有主張以1%過碘酸鉀(KIO4)代替H2O2的。
。3)雙蒸水洗3次,每次10min,第1,2次洗法如(2),浮于液滴上,第3次以盛雙蒸水的注射器沿鎳網(wǎng)面沖洗,水流應(yīng)有適當(dāng)壓力,但不宜過高強(qiáng),用濾紙?jiān)诰W(wǎng)緣將水吸干。醫(yī)學(xué) 全在.線提供www.med126.com
(4)浮于正常羊血清(1:50~1:100)滴上,室溫30~60min,以飽和固定劑中的游離醛基占據(jù)非特異性結(jié)合部位。
。5)PBS漂洗3min,洗1次(有人主張不洗)。
。6)濾紙吸干,孵育于第一抗體血清滴上,先室溫預(yù)孵1h,再置于4℃24~36h。
。7)PBS漂洗3min,3次。
。8)PBS(內(nèi)含1%的牛血清白蛋白)pH8.2中,5min,此步為膠體金結(jié)合作準(zhǔn)備。
。9)膠體金標(biāo)記抗體液1:30~1:100,淡紅色為適宜稀釋液,室溫孵育10min至1h。
。10)雙蒸水洗3min,3次。
如作雙重染色,則應(yīng)將鎳網(wǎng)翻過來,用另一類抗體血清,重復(fù)上述步驟(2)~(10)。
。11)5%醋酸鈾(雙蒸水配制)染5min,然后用雙蒸水洗。
。12)枸櫞酸鈾(或醋酸鉛)染色5min,雙蒸水洗凈。
(13)電鏡觀察。
2.包埋前染色
(1)組織經(jīng)過適當(dāng)固定,為增強(qiáng)細(xì)胞穿透性,可在固定液中加入皂角素(Saponin),使其濃度為0.01%,經(jīng)含皂角認(rèn)固定劑處理5~8min后,應(yīng)用0.01mol/l PBS Ph7.4沖洗12h左右,中間換洗3~4次。
(2)組織切片貼于明膠涂抹的坡片上,細(xì)胞可制成混懸液,用離心法操作或制成涂片。
(3)0.05mol/l PBS pH7.4洗3min。
。4)以1:5正常羊血清處理切片30min室溫,以阻斷非特異性吸附。
。5)第一抗體4℃孵育20h后室溫2h或過夜。
。6)0.05mol/l TBS pH7.4洗3min×3。
。7)0.02mol/l TBS pH8.2洗3min×3,為與膠體金結(jié)合作準(zhǔn)備。
(8)再次阻斷非特異性吸附,同(4)。
(9)以金標(biāo)記的第二抗體(工作濃度1:40左右)在室溫下孵育1h。
。10)0.05mol/l TBS pH8.2洗3min。
(11)0.05mol/l TBS pH7.4洗3min×3
。12)1%鋨酸(0.1mol/l PBS溶液)1h。
。13)雙蒸水洗15min。
(14)系列酒精或丙酮脫水,包埋、超薄切片。(15)枸椽酸鉛對(duì)照染色。
為增加抗非特異性染色,有的實(shí)驗(yàn)室傾向在TBS中加入1%小牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA, Sigma)。理想的免疫金染色切片,背景應(yīng)清潔,無殘留的金或其他無機(jī)鹽顆粒,金粒集中在抗原、抗體反應(yīng)部位。要獲得理想的免疫金染色切片,需注意的因素很多,其中主要的如:①抗體血清的高度特異性和親和力;②被檢組織應(yīng)有較高濃度的抗原;③沖洗液的清潔度,沖洗的徹底程度以及整個(gè)過程中應(yīng)用的各種器皿的清潔度等;④所有溶液最好用微孔濾過器(milipore filter濾過),濾膜孔徑0.2~0.45μm,所有器皿應(yīng)清潔和專用。整個(gè)操作過程應(yīng)在濕盒內(nèi)進(jìn)行,以使載網(wǎng)保持濕潤(rùn)。