三、膠體金雙標記技術(shù)（常用為蛋白A—膠體金)
1．單面法以不同直徑的金粒分別標記兩種不同的抗體，以間接法先染第一種抗體，洗凈后再染第二抗體。
2．雙面法以不同直徑的金粒標記的抗體于鎳網(wǎng)的兩面分另進行免疫染色。本法的優(yōu)點是可防止兩種金標記的抗體的相互干擾，又可防止第一次應用的一抗與其相應的抗原相結(jié)合，占據(jù)了空間，第二次應用的抗體沒有適合的空間使之與相應的抗原相結(jié)合。
3．異種動物抗原—抗體染色法如一抗分別用人與兔抗血清，人抗組織抗原A，兔抗組織抗原B。第二抗體分別以不同直徑金粒標記的抗人和兔免疫球蛋白。由于種屬不同，兩種抗血清不會互相干擾，在應用一抗和二抗時都可將兩種血清一次混合使用，將四步減少為兩步。
4．金標記抗原檢查法（Gold—labelled antigen detection method, GLAD 法)此法是Larson（1977)年首先提出的，應用放射性同位素如125I或酶標記抗原進行染色。先用特異性抗體與組織抗原反應，標記的純抗原又與特異性抗體反應。Larson（1980，1981)又在此基礎(chǔ)上提出應用膠體金在電鏡水平進行雙抗原甚至多抗原定位。GLAD原理是：雙價的Ig抗體分子過量地加到有抗原的組織切片上，使分子的兩個抗原結(jié)合點中有一個結(jié)合到組織抗原上，而另一端可與標記金的抗原起反應。雙標記時，預先將兩種不同的抗原標以不同直徑的金粒，可分別與相應的第一抗體相結(jié)合，從而顯示出兩種抗原在組織切片的定位。此法的優(yōu)點是標記物所顯示出的組織抗原的部位經(jīng)過兩次選擇，標記了抗原只能與相應的特異性抗體相結(jié)合而不能與切片中非特異性Ig相結(jié)合，因此具有較高的特異性。但由于使用此法時需備有與欲檢抗原相同的純抗原，并要對不同抗原分別進行標記，非一般實驗室所能做到，所以至今尚未被廣泛應用。
雙面金標記法操作程序（Cai et al 1993, 改良自Bendayan et al 1982).
�。�1)鎳網(wǎng)面A（樹脂包埋)
�、僬麴s水沖10min。
�、�10% H2O2蝕刻10min室溫
�、�10%正常血清（以0.5mol/l Tris緩沖液pH7.4、含1%BSA和2%Tween20 稀釋，簡稱TBT緩沖液)室溫30min。
④以濾紙吸去多余液體，覆于特異性第一抗體1：500（Tris 緩沖液，pH7.4,含1%BSA和0.1%疊氮鈉)4℃，孵育過夜
⑤徹底清洗，應用0.5mol/L Tris緩沖液pH7.2,不含BSA
⑥繼之用0.5mol/L Tris緩沖液pH7.6,含1%BSA沖洗
�、�0.5mol/L Tris緩沖液pH8.2,含1%BSA，室溫孵15min
�、嘌蚩雇肐gG標記以15nm金粒，應用0.5mol/l Tris緩沖液pH8.2、含1%BSA稀釋1：40，孵育2h，室溫
�、�0.5mol/L Tris緩沖液pH7.4 沖洗
�、庹麴s水沖洗
�。�2)鎳網(wǎng)面B，重復①～⑩，只在第④時更改另一特異性一抗，在⑧時羊抗兔IgG標記以5nm金粒。
�。�3)鈾鉛雙重染色，電鏡觀察，可見二種不同直徑金粒標記。
注意事項：①所有溶液均須經(jīng)加有微孔濾紙（0.45μm孔，國內(nèi)外現(xiàn)均有商品提供)的注射器過濾，過濾后直接以注射器沖洗。②濾紙最好用無纖維吸水濾紙。③沖洗在膠金標記技術(shù)上是個決定性關(guān)鍵，僅次于抗體血清的純度。筆者的體會是一般應漂洗3×5min，以注射器噴水漂洗效果優(yōu)于杯漂洗法，但漂洗水流需與網(wǎng)面平行，勿使水壓破壞切片。
