下面介紹RNA甲醛凝膠電泳和吸印方法：
�。�1)試劑
10×MSE緩沖液：0.2mol/L 嗎啉代丙烷磺酸（MOPS)，pH7.0, 50mmol/L 醋酸鈉，1mmol/l EDTA, pH8.0。
5×樣品緩沖液：50%甘油，1mmol/l EDTA, 0.4%溴酚藍。
甲醛：用水配成37%濃度（12.3mol/L)。應(yīng)在通風(fēng)柜中操作，pH高于4.0。
去離子甲酰胺。
50mmol/L NaOH(含10mmol/l NaCl)。
0.1mol/L Tris·HCl,Ph7.5。
�。�2)步驟
�、�40ml水中加7g瓊脂糖，煮沸溶解，冷卻到60℃，加7ml 10×MSE緩沖液、11.5ml甲醛，加水定容 至70ml，混勻后 倒入盛膠槽。
�、诘饶z凝固后，去掉梳子和膠布，將盛膠槽放入1×MSE緩沖液的電泳槽。
�、凼筊NA變性（最多20μg)：RNa 4.5μl，10×MSE緩沖液2.0μl，甲醛3.5μl，去離子甲酰胺10.0μl。
�、�55℃加熱15min，冰浴冷卻。
�、菁�2μl 5×載樣緩沖液。
�、奚蠘樱瑫r加RNA標記物。
⑦60伏電泳過夜。
�、嗳〕瞿z，水中浸泡2次，每次5min。
�、崾覝叵聦⒛z浸到50mmol/L NaOH和10mmol/l NaCl中45min，水解高分子RNA，以增強轉(zhuǎn)印。
�、馐覝叵聦⒛z浸到0.1mol/L Tris·HCl (Ph7.5)中45min，使膠中和。
�、�20×SSC洗膠1h。
�、�20×SSC中過夜，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。
�、讶〕鱿跛崂w維膜，80℃真空烘烤2h。
5．組織原位雜交（Tissue in situ hybridization) 組織原位雜交簡稱原位雜交，指組織或細胞的原位雜交，它與菌落的原位雜交不同。菌落原位雜交需裂解細菌釋出DNA，然后進行雜交。而原位雜交是經(jīng)適當處理后，使細胞通透性增加，讓探針進入細胞內(nèi)與DNA或RNA雜交。因此原位雜交可以確定探針的互補序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。例如，對致密染色體DNA的原位雜交可用于顯示特定的序列的位置；對分裂期間核DNA的雜交可研究特定序列在染色質(zhì)內(nèi)的功能排布；與細胞RNA的雜交可精確分析任何一種RNA在細胞中和組織中的分布。此外，原位雜交還是顯示細胞亞群分布和動向及病原微生物存在方式和部位的一種重要技術(shù)。
用于原位雜交的探針可以是單鏈或雙鏈DNA，也可以是RNA探針。通常探針的長度以100～400nt為宜，過長則雜交效率減低。最近研究結(jié)果表明，寡核苷酸探針（16～30nt)能自由出入細菌和組織細胞壁，雜交效率明顯高于長探針。因此，寡核苷酸探針和不對稱PCR標記的小DNA探針或體外轉(zhuǎn)錄標記的RNA探針是組織原位雜交的優(yōu)選探針。
探針的標記物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物素和半抗原等。放射性同位素中，3H和35S最為常用。3H標記的探針半衰期長，成像分辨率高，便于定位， 缺點是能量低。35S標記探針活性較高，影像分辨率也較好。而32P能量過高，致使產(chǎn)生的影像模糊，不利于確定雜交位點。
原位雜交中，標本的固定條件是影響雜交效率的重要因素，標本組織蛋白質(zhì)的消化程度對探針進入細胞極為重要。去除蛋白的方法是，用0.2mol/l HCl處理載玻片，用蛋白酶K消化，然后用不同濃度的乙醇脫水，原位雜交還是一種新技術(shù)，發(fā)展很快，在敏感性、特異性和穩(wěn)定性上還需要進一步完善和提高（詳見二十章 )。
6．固相夾心雜交 Dunn等最早介紹了夾心雜交類型，Ranki等又作了進一步的改進。夾心雜交法比直接濾膜雜交法有兩個主要的優(yōu)點：①樣品不需要固定，對粗制樣品能做出可靠的檢測；②用夾心雜交法比直接濾膜雜交法特異性強，因為只有兩個雜交物都雜交才能產(chǎn)生可檢測的信號。
固相夾心雜交需要兩個靠近而不互相重疊的探針，一個作固相吸附探針，另一個作標記檢測探針。樣品基因組內(nèi)核酸只有使這兩個探針緊密相連才能形成夾心結(jié)構(gòu)。需注意的是兩個探針必須分別亞克隆進入兩個分離的非同源載體內(nèi)，以避免產(chǎn)生高的本底信號（如一個克隆人Puc19,另一克隆人pBR322)。
夾心雜交法可用濾膜和小珠固定吸附探針，使用小珠可更好地進行標準化試驗和更容易對小量樣品進行操作。Dahlen 等利用微孔板進行夾心雜交，可同時進行大量樣品檢測，他們先吸取DNA探針加到凹板中，然后用紫外線照射使其固定到塑料板上。用微孔板進行夾心雜交還可直接用于PCR技術(shù)。應(yīng)用光敏生物標記探針檢測PCR產(chǎn)物的敏感性和用32P標記探針（3×108cpm/μg)作16h放射自顯影的Southern雜交的敏感性一樣。用微孔板雜交的其它優(yōu)點還包括同時做多份樣品，加樣、漂洗和讀結(jié)果等步驟可以自動化。
7．其它雜交類型
�。�1)固化探針雜交：該法較少使用，原理是使未標記固化探針通過雜交與靶RNA或DNA結(jié)合，漂洗后，用酶標抗DNA：RNA抗體或抗DNA：DNA抗體與雜交物結(jié)合。將乳膠顆粒收集，吸附到膜上后漂洗，加入底物顯色并進行測定。探針濃度2μg/ml,80℃雜交，可在10～15min完成，檢測的敏感性為5×108靶序列。
（2)反向雜交：這個雜交類型是用標記的樣品核酸與未標記的固化探針DNA雜交，故稱為“反向雜交”。這種雜交方法的優(yōu)點是在一次雜交反應(yīng)中，可同時檢測樣品中幾種核酸 。這種雜交方式主要用于進行中的核酸轉(zhuǎn)錄試驗和多種病原微生物的檢測。前者是在轉(zhuǎn)錄過程中標記RNA探針，后者可用光敏生物素制劑BPA標記樣品核酸。
�。ㄈ�)固相膜核酸雜交的幾點說明
1．雜交膜的選用 雜交膜是一種多孔、表面積很大的固相載體，核酸一旦固定在上面，就可用雜交法進行檢測。最常使用的膜是硝酸纖維素膜，用于放射性和非放射笥標記探針都很方便，產(chǎn)生的本底淺，與核酸結(jié)合的化學(xué)性質(zhì)不是很清楚，推測為非共價鍵結(jié)合。經(jīng)80℃烤干2h和雜交處理后，核酸仍不會脫落。硝酸纖維素膜的另一特點是只與蛋白有微弱非特異結(jié)合，這在使用非同位素探針中尤為有用。硝酸纖維素膜的缺點是結(jié)合核酸能力的大小取決于轉(zhuǎn)印條件和高濃度鹽（＞10×SSC)，與小片段核酸（＜200bp)結(jié)合不牢，質(zhì)地脆，不易操作。醫(yī)學(xué)全在線quanxiangyun.cn
尼龍膜在某些方面比硝酸纖維素膜好，它的強度大、耐用，可與小至10bp的片段共價結(jié)合。在低離子濃度緩沖液等多種條件下，它們都可與DNA單鏈或RNA緊密結(jié)合，且多數(shù)膜不需燒烤。尼龍膜韌性好，可反復(fù)處理與雜交，而不丟失被檢標本。它通過疏水鍵和離子鍵與核酸結(jié)合，結(jié)合力為350～500μg/cm2，比硝酸纖維素膜（80～100μg/cm2)強許多。尼龍膜的缺點是對蛋白有高親合力，不宜使用非同位素探針。
2．“噪音”的排除 “噪音”（noise)是固相膜雜交方法常遇到的問題，指標記DNA結(jié)合到空白膜上的放射性計數(shù)，即本底。這個問題的克服一是使用高純度的核酸制品和充分嚴格的雜交條件：二是選擇合適的雜交反應(yīng)液和對膜進行處理。研究發(fā)現(xiàn)，隨著離子強度的增加，空白膜（未固定DNA對照膜)上的“噪音”水平增加，而在50%甲酚胺6×SSC的雜交反應(yīng)液中充分封閉膜上的多余非特異結(jié)合位點。
