五、核酸分子雜交的類(lèi)型
隨著基因工程研究技術(shù)的迅猛發(fā)展，新的核酸分子雜交類(lèi)型和方法在不斷涌現(xiàn)和完善。核酸分子雜交可按作用環(huán)境大致分為固相雜交和液相雜交兩種類(lèi)型。固相雜交是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應(yīng)核酸游離在溶液中。固體支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等。液相雜交所參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。
由于固相雜交后，未雜交的游離片段可容易地漂洗除去，膜上留下的雜交物容易檢測(cè)和能防止靶DNA自我復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，故該法最為常用。常用的固相雜交類(lèi)型有：菌落原位雜交、斑點(diǎn)雜交、狹縫雜交、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、組織原位雜交和夾心雜交等。
液相雜交是一種研究最早且操作復(fù)合的雜交類(lèi)型，在過(guò)去的30年里雖有時(shí)被應(yīng)用，但總不如固相雜交那樣普遍。其主要原因是雜交后過(guò)量的未雜交探針在溶液中除去較為困難和誤差較高。近幾年由于雜交檢測(cè)技術(shù)的不斷改進(jìn)，商業(yè)性基因探針診斷盒的實(shí)際應(yīng)用，推動(dòng)了液相雜交技術(shù)的迅速發(fā)展。下面對(duì)固相雜交和液相雜交分別進(jìn)行介紹。
（一)固相膜核酸分子雜交方法
固相核酸雜交多是在膜上進(jìn)行，因此，以下主要介紹固相膜的核酸分子雜交方法：
1．DNA的變性 DNA變性解鏈?zhǔn)请s交成功的關(guān)鍵。Southern印跡雜交時(shí)DNA在凝膠中變性，變性方法是將凝膠浸在數(shù)倍體積的1.5mol/l NaCl和0.5mol/l NaOH中1h然后用數(shù)倍體積的1mol/l Tris –HCl(Ph8.0)和1.5mol/l NaCl溶液中和1h。DNA受酸、堿、熱等處理均能發(fā)生變性，但強(qiáng)酸會(huì)使核酸降解。一般認(rèn)為堿變性較好，可避免DNA降解。熱變性在要低DNA濃度（100μg/ml)和低鹽濃度（0.1mol/l SSC 含15mmol/l NaCl - 1.5mmol/L檸檬酸三鈉，pH7.0)下進(jìn)行。用SSC稀釋DNA溶液為50μg/ml,加10mol/l NaOH使最終濃度為0.1mol/L（pH約12.8)，室溫變性10min，很快置冰鹽水中，用10min/l HCl或5mol/l NaH2PO4調(diào)pH到7～8[亦可用堿變性后，調(diào)至中性，再加熱100。c 10min]，DNA變懷可用OD260增加（約30%～40%)來(lái)檢測(cè)，變性DNA醇沉淀呈雪樣，完全失去纖維狀沉淀。變性后加入等量冷的12×SSC，冰浴保存。
2．變性DNA在硝酸纖維素膜上的固定 硝酸纖維素濾膜（孔徑0.45μm)先在蒸餾水中充分浸泡，再用6×SSC浸泡30min～2h，涼干。DNA樣品轉(zhuǎn)移或加至硝酸纖維素膜上后，先室溫干燥4h，然后在80。C真空干燥2h。
3．預(yù)雜交 濕潤(rùn)的濾膜放入可加熱封口的塑料袋中，按每平方厘米濾膜加0.2ml預(yù)熱至60。C的預(yù)雜交液（6×SSC，0.5%,SDS,5×Denhardt液，100μg/ml鮭魚(yú)精DNA)。鮭魚(yú)精DNA需經(jīng)過(guò)剪切和DNA酶消化處理，然后酒精沉淀純化，調(diào)濃度至10mg/ml，用前放100。C水浴中煮沸變性10min，冰水驟冷。盡可能將袋中氣泡趕盡，可封口器將袋口封住。將雜交袋浸入68。C水浴保溫3~12h。當(dāng)預(yù)雜交液溫度升至68。C時(shí)，在濾膜表面常會(huì)形成小氣泡。輕輕晃動(dòng)袋中液體即可除去這些小氣泡，這一點(diǎn)對(duì)于保證濾膜表面充分浸潤(rùn)預(yù)雜交液很重要。
4．雜交 從水浴中取出塑料袋，用剪刀剪開(kāi)一角，盡可能擠凈預(yù)雜交液。用吸管或大槍頭將雜交液加入袋中，用恰好是足量的液體保持濾膜濕潤(rùn)（50μl/cm2)。溶液的組成是6×SSC，0.01mol/l EDTA, 變性的標(biāo)記核酸探針，5×Denhardt液，0.5%SDS, 100μg/ml變性的鮭魚(yú)精DNA。盡可能趕盡氣泡后，將塑料袋嚴(yán)密封口，雜交反應(yīng)在68℃水浴中進(jìn)行，所需時(shí)間視探針和檢測(cè)靶DNA的性質(zhì)及探針的比活性等情況而定，一般4～20h。
5．洗膜 取出塑料袋，用剪刀剪開(kāi)，小心取出濾膜，立即浸入盛有2×SSC和0.5%SDS溶液的盤(pán)中，室溫下漂洗5min。再將濾膜移入2×SSC和0.1%SDS溶液中，室溫下洗滌15min（輕輕搖動(dòng))。然后將濾膜移入0.1×SSC和0.5%SDS溶液中；68℃輕輕搖動(dòng)保溫2h，更換緩沖液后繼續(xù)保溫30min。
洗膜的溫度一般應(yīng)控制在低于Tm值12℃以上。（Tm = 69.3 + 0.41x(G +C) %)。雙鏈DNA的Tm值隨錯(cuò)配堿基對(duì)數(shù)每增加1%而遞減1℃。
6．結(jié)果顯示 非放射性檢測(cè)方法前已述及，此處主要介紹放射性測(cè)定方法。固相膜的放射性雜交結(jié)果顯示有兩種方式，一是放射性自顯影法，另一種是液閃計(jì)數(shù)法。前一種方法比較簡(jiǎn)單，只需將雜交膜與X光片在暗盒中曝光數(shù)小時(shí)至數(shù)天，再顯影、定影即可。對(duì)于雜交信號(hào)較弱的固相膜，用一塊增感屏可顯著增強(qiáng)曝光強(qiáng)度。此外，為了減弱32P的散射，曝光通常在-20℃或-80℃下進(jìn)行。液閃計(jì)數(shù)法主要用于打點(diǎn)和狹縫雜交及為了比較兩個(gè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱等情形。方法是將完成雜交的膜在漂洗結(jié)束后剪成小塊（每份樣品1塊)，80℃真空干燥后裝閃爍瓶。加入2～5ml閃爍液，剪2～3塊無(wú)樣品膜塊作為本底對(duì)照。在液體閃爍計(jì)數(shù)器上自動(dòng)計(jì)數(shù)。液體計(jì)數(shù)測(cè)定放射性強(qiáng)度也可在放射自顯影之后進(jìn)行。
�。ǘ�)固相核酸分子雜交類(lèi)型
1．菌落原位雜交（Colony in situ hybridization) 菌落原位雜交是將細(xì)菌從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA。將NDA烘干固定于膜上與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測(cè)菌落雜交信號(hào)，并與平板上的菌落對(duì)位。
實(shí)驗(yàn)步驟如下：
①將硝酸纖維素濾膜置于含抗生素的平皿瓊脂培養(yǎng)基上，用無(wú)菌牙簽挑取單菌落種于濾膜和主瓊脂平板上，排列成方格柵，膜和板上菌落位置相同。
②培養(yǎng)細(xì)菌至產(chǎn)生1～2mm大小的菌落。
�、墼谝粔K平皿中置4張濾紙，用10%SDS浸透，倒掉多余液體。將帶有菌落的濾膜取下，輕輕置于濾紙上，菌落面上在，注意防止在濾膜底面存有氣泡。
�、�5min后，將濾膜轉(zhuǎn)至用變性溶液（0.5mol/l NaCl , 0.5mol/L Tris·NaCl)浸濕的濾紙上，放置10min。
�、輰V膜轉(zhuǎn)至中和溶液（1.5mol/l NaCl , 0.5mol/L Tris·HCl ，pH8.0)浸濕的濾紙上，放置10min。重復(fù)中和1次。
�、迣V膜移至用2×SSPE溶液浸過(guò)的濾紙上，放置10min。SSPE配成20×貯備液：3.6mol/l NaCl, 0.2mol/L NaH2PO4(PH7.4), 20mmol/L EDTA(pH7.4)。
�、邔V膜用濾紙吸干，80℃真空烘干2h。
以下操作參考前述。
2．斑點(diǎn)雜交（Dot blot) 斑點(diǎn)雜交法是將被檢標(biāo)本點(diǎn)到膜上，烘烤固定。這種方法耗時(shí)短，可做半定量分析，一張膜上可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品。為使點(diǎn)樣準(zhǔn)確方便，市售有多種多管吸印儀（manifolds)，如Minifold I和II、Bio-Dot (Bio –Rad )和Hybri –Dot,它們有許多孔，樣品加到孔中，在負(fù)壓下就會(huì)流到膜上呈斑點(diǎn)狀或狹縫狀，反復(fù)沖洗進(jìn)樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標(biāo)本，這時(shí)的膜就可以進(jìn)行雜交。
�。�1)DAN斑點(diǎn)雜交
�、傧葘⒛ぴ谒薪䴘�，再放到15×SSC中。
②將DNA樣品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。
�、塾�鉛筆在濾膜上標(biāo)好位置，將DNA點(diǎn)樣于膜上。每個(gè)樣品一般點(diǎn)50μl（2～10μg DNA)。
�、軐⒛ず娓桑芊獗４�?zhèn)溆谩?/P>
�。�2)RNA斑點(diǎn)雜交：與上法類(lèi)似，每個(gè)樣品至多加10μg總RNA（經(jīng)酚/氯仿或異硫氰酸胍提取純化)。方法是將RNA溶于5μlDEPC水，加15μl甲醛/SSC緩沖液（10×SSC中含0.15mol/l 甲醛)使RNA變性。然后取5～8μl點(diǎn)樣于處理好的濾膜上，烘干。
培養(yǎng)細(xì)胞，標(biāo)本處理技術(shù)可以簡(jiǎn)化，不用提取和純化RNA。方法是用含0.5%Nonidet P40的低滲緩沖液對(duì)多種動(dòng)物細(xì)胞作簡(jiǎn)單處理，離心去掉細(xì)胞核和細(xì)胞碎片，就得到基本不帶DNA而富含RNA的細(xì)胞質(zhì)提取物，這一粗RNA在高鹽下用甲醛變性，不需加工直接點(diǎn)到硝酸纖維素膜上。本法可以快速檢測(cè)大量標(biāo)本，而只需極少量的細(xì)胞（5×104)或組織。
整個(gè)RNA實(shí)驗(yàn)中，要防止激活內(nèi)源性RNase，有許多種預(yù)防措施，有一種是在樣品中加入核糖核苷氧礬基復(fù)合物（RVC)。
�。�3)完整細(xì)胞斑點(diǎn)雜交：應(yīng)用類(lèi)似檢測(cè)細(xì)菌菌落的方法，可以對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物的特異序列進(jìn)行快速檢測(cè)。將整個(gè)細(xì)胞點(diǎn)到膜上，經(jīng)NaOH處理，使DNA暴露、變性和固定，再按常規(guī)方法進(jìn)行雜交與檢測(cè)。有人曾用此法從105個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞中檢測(cè)到少至5pg 的Epstein – Barr病毒DNA。完整細(xì)胞斑點(diǎn)印跡法可以用于篩選大量標(biāo)本，因?yàn)樗鞘辜?xì)胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法還高，又不影響與32P標(biāo)記的探針雜交。但它不適于非放射性標(biāo)記探針，因?yàn)镈NA純度不夠，會(huì)產(chǎn)生高本底。
3．Southern印跡雜交（southern blot ) Southern blot 是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，在遺傳診斷DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價(jià)值。Southern印跡雜交基本方法是將DNA標(biāo)本用限制性?xún)?nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段，然后經(jīng)堿變性，Tris緩沖液中和，高鹽下通過(guò)毛吸作用將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜上，烘干固定后即可用于雜交。凝膠中DNA片段的相對(duì)位置在DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜的過(guò)程中繼續(xù)保持著。附著在濾膜上的DNA與32P標(biāo)記的探針雜交，利用放射自顯影術(shù)確定探針互補(bǔ)的每條DNA帶的位置，從而可以確定在眾多酶解產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。
�。�1)瓊脂糖凝膠電泳：利用瓊脂糖凝膠電泳可以很容易地將DNA限制酶消化片段（0.3～25kb)分離開(kāi)。分離大分子DNA片段（800～12000bp)用低濃度瓊脂糖（0.7%)，分離小分子片段（500～1000bp)用高濃度瓊脂糖（1.0%),300～5000bp的片段則用1.3%的瓊脂糖凝膠，根據(jù)分離樣品量、分離速度和分辨率要求的不同，可選用不同規(guī)格的電泳槽。
電泳時(shí)，同時(shí)將標(biāo)記物加到旁邊孔中，便于確定樣品DNA的分子量。20伏恒壓電泳過(guò)夜。電泳畢，將膠浸到含0.5μg/ml EB的TBE緩沖液中染色30min，也可將EB直接加到電泳緩沖液中或在配膠前加入膠中，在254nm短波透射燈下拍照，加橙黃色濾色鏡，使用高速一次成像膠片，光圈f4.5,曝光20～40s。
�。�2)硝酸纖維素濾膜吸印。
�、賹⒛z切成合適大小，切去右上角作為記號(hào)。
�、趯⒛z放進(jìn)盛有變性緩沖液（1.5mol/l NaCl, 0.5mol/L NaOH)的盤(pán)中輕搖動(dòng)15min。
�、蹞Q到中和緩沖液（1mol/L Tris·HCl , pH8.0, 1.5mol/L NaCl)中輕搖動(dòng)30min。
④裁一張硝酸纖維素膜，2～4張3MM濾紙和一些吸印紙（可用衛(wèi)生紙)，都與膠的大小相同（硝酸纖維素膜和吸印紙不能比膠大，否則易形成旁路)，先將硝酸纖維素膜浸到水中，再放入10×SSC中，接觸膠和硝酸纖維素膜時(shí)都要戴橡膠手套操作。
⑤平盤(pán)上放一塊比膠大的平板（盛膠槽翻過(guò)來(lái)即可)，上面鋪一張3MM濾紙，起燈芯作用，盤(pán)中加少量10×SSC緩沖液（2.5cm厚)，不能沒(méi)過(guò)平板，使3MM濾紙充分飽和。
�、迣⒛z倒扣到3MM濾紙上。
�、呓䴘竦南跛崂w維素鋪在膠上，對(duì)齊，鋪膜時(shí)從一邊逐漸放下，防止產(chǎn)生氣泡，有氣泡時(shí)，可用吸管趕出，不能讓膜與膠下的濾紙直接接觸。
⑧膜上放一張3MM濾紙，不能與膠接觸。
�、嵘厦婕游〖埣爸匚铮�500g左右)。
�、馔ㄟ^(guò)濾紙的灶芯作用，平盤(pán)中的緩沖液就會(huì)通過(guò)膠上移，從而將DNA吸印到膜上，及時(shí)更換浸濕的吸印紙。在室溫下轉(zhuǎn)印過(guò)夜。
⑾去除上面的東西，用鑷了將膜取出，在6×SSC中洗一下（也可不洗)。
⑿自然干燥，80℃烤2h。
�、堰@時(shí)的膜就可進(jìn)行雜交，或室溫密封保存。
4．Northern印跡雜交（Northern blot) 這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。DNA印跡技術(shù)由Southern于1975年創(chuàng)建，稱(chēng)為Southern印跡技術(shù)。RNA印跡技術(shù)正好與DNA相對(duì)應(yīng)，故被趣稱(chēng)為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)則被稱(chēng)為western blot。Northern印跡雜交的RNA吸印與Southern印跡雜交的DNA吸印方法類(lèi)似，只是在進(jìn)樣前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因?yàn)樗鼤?huì)水解RNA的2’-羥基基團(tuán)。RNA變性后有利于在轉(zhuǎn)印過(guò)程中與硝酸纖維素膜結(jié)合，它同樣可在高鹽中進(jìn)行轉(zhuǎn)印，但在烘烤前與膜結(jié)合得并不牢固，所以在轉(zhuǎn)印后不能用低鹽緩沖液洗膜，否則RNA會(huì)被洗脫。在膠中不能加EB，因它為影響RNA與硝酸纖維素膜的結(jié)合，為測(cè)定片段大小，可在同一塊膠上加標(biāo)記物一同電泳，之后將標(biāo)記物膠切下，上色、照像。樣品膠則進(jìn)行Northern轉(zhuǎn)印，標(biāo)記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含5μg/ml EB的0.1mol/L 醋酸銨中10min，在水中就可脫色。在紫外光下用一次成像相機(jī)拍照時(shí)，上色的RNA膠要盡可能少接觸紫外光，若接觸太多或白熾燈下暴露過(guò)久，會(huì)使RNA信號(hào)降低。從瓊脂糖凝膠中分離功能完整的mR－NA時(shí)，甲基氫氧化汞是一種強(qiáng)力、可逆變性劑，但是有毒，因而許多人喜用甲醛作為變性劑。所有操作均應(yīng)避免RNase的污染。
