自1983年澳大利亞的Warran和Matshall從慢性活動性胃炎病人胃粘膜活檢標(biāo)本中找到幽門螺桿菌（Helicobacter pylori,Hp)后，先后已有英國、荷蘭、德國、美國、加拿大、日本、秘魯及我國從慢性胃炎和消化性潰瘍等病人中分離到此菌。這此些報道普遍反映了胃粘膜中Hp檢出與慢性胃炎、消化性潰瘍的存在兩者之間有高度的相關(guān)性。Matshall(1985)和Morris(1987)先后還用Hp作自身感染實驗，均證明能引起急慢性胃炎，Morris并觀察到能發(fā)展成慢性胃炎，這進(jìn)一步證實了Hp對人類胃粘膜致病的可能性。但Hp如何致�。縃p是否屬于彎曲菌屬？目前仍存在著爭議。為此，本文用透射和掃描電鏡對Hp形態(tài)結(jié)構(gòu)及其與胃粘膜上皮的關(guān)系進(jìn)行了觀察，旨在為闡明Hp的生物學(xué)地位及致病性提供某些線索。
1 材料和方法
1.1 活檢標(biāo)本及菌種
33例活檢標(biāo)本采自經(jīng)內(nèi)窺鏡診斷為淺表性或萎縮性胃炎患者近幽門部位的胃粘膜。Hp菌種31株，從慢性胃炎或消化性潰瘍患者胃粘膜活檢中分離而得。空腸彎曲菌（Campylobacterjejuni,CJ)菌株：CJ（CF-1)由上海市衛(wèi)生防疫站提供：CJ（82-56)由蘇州醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室提供。胎兒彎曲菌（Campylobacter fetus,CF)及結(jié)腸彎曲菌（Campylobactercoli,CC)菌種各兩株，其中CF（GIFu 8735)及CC（GIFU 8733)由日本大阪大學(xué)三輪各俊夫教授提供，另有CF及CC各一株由法國巴黎第五大學(xué)Berche教授提供。
1.2 電鏡檢查
1.2.1 透射電鏡標(biāo)本制備活檢標(biāo)本在含2.0%戊二醛的二甲砷酸鈉緩沖液（pH7.3)中固定2h～4h，二甲砷酸鈉緩沖液洗2次后在1%四氧化鋨中作后固定、包埋、超薄切片。菌株超切片標(biāo)本取自血平板上培養(yǎng)2d～3d的菌落。無菌生理鹽水輕輕洗下，3000r/min20min離心沉淀，棄上清，以無菌生理鹽水重復(fù)洗滌一次后，取沉淀作透射電鏡標(biāo)本制備，方法同上。
細(xì)菌懸滴標(biāo)本制備：于清潔蠟塊上滴一滴新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌懸液，以噴涂炭膜的銅網(wǎng)覆蓋其上，靜止15min，取下銅網(wǎng)，用濾紙吸去殘剩液體。再覆蓋在一滴20%的磷鎢酸上負(fù)染15min，取下銅網(wǎng)，吸去殘剩液體，自然干燥后待檢。上述各標(biāo)本在日立-500電鏡下觀察。
1.2.2 掃描電鏡標(biāo)本制備活檢標(biāo)本（用生理鹽水洗去表面雜菌及粘液)在戊二醛二甲砷酸鈉固定液中固定2h～3h，經(jīng)二甲砷酸鈉緩沖液洗2次后，直接在乙醇中作梯度脫水，然后移入100%醋酸異戊酯，在臨界點下干燥，真空涂金。菌落標(biāo)本制備：取經(jīng)2d～3d培養(yǎng)的Hp血平板，選擇菌落生長良好區(qū)域，節(jié)下約1cm2瓊脂塊，輕輕浸入上述電鏡標(biāo)本固定注中固定。隨后制備步驟同上。上述標(biāo)本均在JEOlJSM-840掃描電鏡下觀察。
2 結(jié)果
2.1 Hp的形態(tài)結(jié)構(gòu)從不同病人胃粘膜上分離得Hp的形態(tài)結(jié)構(gòu)基本一致，呈“S”形彎曲、弧形或稍直，偶見分支狀。一般表面較光滑，末端或二端（多數(shù)為一端)具有2～6條鞭毛，長度稍長于菌體。鞭毛外均有明顯的鞘，帶鞘的鞭毛直徑約50nm的圓球狀結(jié)構(gòu)相連。菌體末端鞭毛基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)內(nèi)側(cè)，有一寬達(dá)200nm～400nm的電子密度明顯降低區(qū)域，其底部無明顯的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)為界。在光滑的菌體表面有進(jìn)呈現(xiàn)大小較均勻、排列整齊的突起。在參考菌株中，CJ與CC末端呈圓錐體樣，稍尖，頂端明顯地呈吸盤樣結(jié)構(gòu)。GF亦見較小的吸盤樣凹陷。CF，CC，CF均有單根無鞘端鞭毛從頂端的吸盤樣凹陷中伸出。根部均未見圓球體狀基礎(chǔ)，CJ與CC均未見電子密度明顯降低區(qū)域。
2.2 Hp與胃粘膜上皮的關(guān)系活檢標(biāo)本包括胃粘膜及其表面的粘液兩部分。一般情況下，quanxiangyun.cn/kuaiji/胃粘膜上皮與粘液層間不存在細(xì)菌。若出現(xiàn)細(xì)菌，常為大小、形態(tài)都呈彎曲樣特征的菌群。多聚居在胃小凹的細(xì)胞與細(xì)胞間連接處部位。偶然尚可見Hp存在于壁細(xì)胞的分泌小管中。Hp與粘膜上皮細(xì)胞間保持一定的間距，借眾多的細(xì)絲狀網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使兩者互相粘附。另一種是細(xì)菌的部分細(xì)胞壁與上皮細(xì)胞的細(xì)膜膜直接相貼粘附，二者間幾無間距。以前者較為多見，有時在同一細(xì)菌可出現(xiàn)兩種粘附現(xiàn)象。在粘膜上皮表面有Hp粘附的區(qū)域附近，往往有炎性細(xì)胞的浸潤和滲出。Hp粘附處的上皮細(xì)胞除微絨毛明顯減少或消失外，很少發(fā)現(xiàn)有明顯的細(xì)胞病理學(xué)變化。胃粘膜上皮細(xì)胞中偶見對Hp吞噬現(xiàn)象。粘膜上廠表面的粘液層分不溶性粘液與可溶性粘液兩部分。正常情況下不溶性粘液層為包裹在粘膜上皮表面的連續(xù)層，可溶性粘液為其周圍的流動滋潤層。在超薄切片下，出現(xiàn)Hp的標(biāo)本中，Hp在不溶性粘液層中大致呈散在的分布狀態(tài)，且大多呈同方向排列。不溶性粘液中的Hp主要呈橫斷面，而在其外側(cè)的可溶性粘液層中則隨意排列，還可見到縱斷面、橫斷面甚至斜斷面等不同的切面。經(jīng)用無菌生理鹽水充分沖洗的活檢標(biāo)本，在掃描電鏡下可見Hp不規(guī)則地粘附在不溶性粘液層表面。
3 討論
目前彎曲菌屬的分類，主要根據(jù)光鏡下的形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化反應(yīng)及其DNA的G加C百分比含量等。這些性質(zhì)與螺菌族中其他細(xì)菌有很多交叉，以致造成對Hp歸屬的意見不一。我們用透射電鏡和掃描電鏡進(jìn)行了形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察，并參考有關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)Hp與CJ，CC，CF在鞭毛源出部位，數(shù)量及結(jié)構(gòu)等方面存在著明顯的不同。例如，Hp與CJ，CC，CF均有端鞭毛。我們從Hp中看到每一根鞭毛有一只鑲嵌在細(xì)胞膜和細(xì)胞壁中的，圓球體為基礎(chǔ)，其內(nèi)側(cè)尚有一明顯的電子密度降低區(qū)。而其他彎曲菌屬細(xì)菌卻未找到此結(jié)構(gòu)，僅CF亦見有電子密度降低區(qū)。由此可見Hp鞭毛及共結(jié)構(gòu)的特征與彎曲菌屬其他細(xì)菌有所不同。而Hp的末端鈍圓等與水螺菌中的一個種（Aquaspirillum serpens,AS)卻相似，因此有人認(rèn)為它很可能屬水螺菌屬。Hp與彎曲菌屬其他細(xì)菌間的區(qū)別除了鞭毛及其有關(guān)結(jié)構(gòu)外，Hp能分解尿素，而其他主要的彎曲菌屬細(xì)菌均不分解尿素，亦是一重要特征。另外還在分類學(xué)上有重要意義的菌體脂肪酸組成、16rRNAHp的部分核苷酸順序分析、菌體蛋白質(zhì)電泳圖譜方面Hp與彎曲菌屬的主要代表菌種之間都有明顯差別。因此Hp是否應(yīng)屬彎曲菌，還值得商榷。
Hp致病機(jī)理，雖然有 Marshall和Morrquanxiangyun.cn/hushi/is等作了自身感染實驗，但它的具體致病機(jī)理仍然缺少解釋。從我們在電鏡下觀察，Hp進(jìn)入機(jī)體后侵入的途徑很可能是：Hp首先粘附在不溶性粘液層表面，然后藉其螺旋狀菌體特征及特殊的鞭毛運動方式迅速鉆入不溶性粘液層中間，繼而與粘膜上皮細(xì)胞接觸，并大多在胃小凹及粘膜上皮細(xì)胞連接處粘附定居。胃中寄生菌雖然不多，但過路菌是很雜的，且胃酸比較強(qiáng)，粘膜表面有不溶性粘液層作屏障，胃粘膜上皮及其分泌的粘液代謝又很快，為什么僅有Hp能在胃粘膜上寄生？這一方面可能由于Hp螺旋狀的菌體特征和它鞭毛的特殊運動方式，促使它比一般腸道桿菌更容易穿透不溶性粘液層。由于不溶性粘液的分子結(jié)構(gòu)呈索條狀，當(dāng)Hp鉆入其間時，易呈相對平行狀態(tài)，這與光鏡下所見Hp在粘液中呈魚貫狀分布相符。另一方面可能由于Hp對粘膜上皮細(xì)胞有特殊的親和結(jié)構(gòu)。正如我們所觀察到的那兩種粘附現(xiàn)象，它們很可能在這中間起著重要的決定作用。這種特異性粘附現(xiàn)象從胃的腸化生組織找不到Hp，在腸的胃脂有利于組織卻能找到，從而間接得到了證明。這種有高度特異的親和機(jī)制促使Hp能克服胃粘膜上皮的不斷代謝更新過程，而繼續(xù)在新生的粘膜上皮上定居寄生。然后可能再通過其生產(chǎn)的細(xì)胞毒素及尿素酶直接和間接作用，造成胃粘膜上皮的局部病損。
Hp表面出現(xiàn)有規(guī)則的突起、在CF、AS中已有報道，Kist認(rèn)為是菌體外膜蛋白層的組成部分，而Winter認(rèn)為是微莢膜。光鏡下所見Hp的微莢膜樣結(jié)構(gòu)可能就屬之。McCoy認(rèn)為這類結(jié)構(gòu)具有抗吞噬作用。但我們將Hp加入新鮮抗凝人血作吞噬實驗，發(fā)現(xiàn)Hp很容易被吞噬。這亦可使胃上皮細(xì)胞對其有吞噬作用得到解釋。從目前觀察到的慢性胃炎病人胃粘膜活檢中出現(xiàn)的一些主要特異性組織病理學(xué)表現(xiàn)，例如炎性細(xì)胞的浸潤和滲出等，很可能是因Hp在胃粘膜上皮細(xì)胞上粘附或被上皮細(xì)胞及炎性細(xì)胞吞噬后釋放的趨化因子所引起，至于Hp是否有其他致病因子，尚待進(jìn)一步研究。
