幽門螺桿菌是近年來從人體胃組織中發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)菌,與胃和胃潰瘍的發(fā)生有密切關(guān)系,而空腸彎曲菌則是近十年來國內(nèi)外學(xué)者較為注意的腹瀉致病菌,這兩種細(xì)菌營養(yǎng)要求及培養(yǎng)條件均較高,特別在菌株保存方面,至今還存在不少問題,為了更好地開展這些疾病的基礎(chǔ)研究,我們對不同種類的彎曲菌,在20%小牛血清布氏肉湯和全羊血中保存,于不同時間檢查了存活情況、生物學(xué)特性及染色體DNA的酶切圖譜,實(shí)驗(yàn)證明,用這種方法保存,在存活率、菌體形態(tài)、生物特性保持較好,染色體DNA酶切帶型前后保持一致。
1 材料和方法
1.1 菌株 幽門螺桿菌自各型胃病患者的胃粘膜中分離,共15株?漳c彎曲菌由國內(nèi)不同地區(qū)分離,共34株(其中人源菌11株,雞源菌8株,鴨源菌6株,鵝源菌4株、豬源菌2株、羊源菌3株),另外從比利時引進(jìn)空腸彎曲菌3株(Cj22,32,26),結(jié)腸彎曲菌2株(Cc25,29)及海鷗彎曲菌3株(Cl34,35,36)和分子量測定用經(jīng)過HindⅢ酶解的標(biāo)準(zhǔn)γ噬菌體DNA。
1.2培養(yǎng)基 試驗(yàn)用培養(yǎng)基用改良布氏瓊脂及布氏肉湯均按參考文獻(xiàn)配制。
1.3quanxiangyun.cn/job/ 染色體DNA提取 彎曲菌經(jīng)37°C48h在混合氣體(10%CO2,5%O2,85%N2)條件下培養(yǎng),每個平皿20mlT.E洗菌,置30ml的離心管,經(jīng)5000rpm/分離心10min,棄上清,沉淀用10mlT.E懸浮,加10%SDS1.5ml于65°C水浴中1h;用酚抽提3次,酚/氯仿異戊醇抽提5次以上,再用氯仿抽提2次;然后透析)T.Hp8.0)24h以上,換T.E4次,用玻棒纏繞經(jīng)異丙醇沉淀的DNA,再用75%乙醇浸泡2次,每次10min,將坡棒倒插,DNA向上,室溫中涼干;用800μlT.E將玻棒上的DNA洗入小離心管中,于-20°C中保存。
1.4 彎曲菌染色體DNA酶切 用PstⅠ,HindⅢ E.coRI,Bg1Ⅱ,XbaⅠ五種酶進(jìn)行試驗(yàn),各種酶均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。
2 結(jié)果
2.1 過氧化氫酶陽性彎曲菌的生物學(xué)特性
對于-70°C條件下保存不同時間的彎曲菌主要生物學(xué)生物學(xué)特性:生長溫度,1%甘氨酸的生長,對萘啶酮酸敏感性,尿素酶活必以及馬尿酸水解,進(jìn)行了檢查與比較,基本特性與初分離時相同,其結(jié)果見表1。
表1 過氧化氫酶陽性彎曲菌經(jīng)-70°C保存后生物學(xué)特性
菌株 | 生長溫度 | 1%甘氨酸生長 | 對萘啶酮酸抗性 | 尿素酶試驗(yàn) | 馬尿酸水解 | ||
25℃ | 37℃ | 43℃ | |||||
幽門螺桿菌 | - | + | - | + | - | + | - |
空腸彎曲菌 | - | + | + | + | - | ― | + |
結(jié)腸彎曲菌 | - | + | + | + | - | ― | - |
海鷗彎曲菌 | - | + | + | + | + | ― | ― |
以上結(jié)果表明在-70C條件下保存,彎曲菌復(fù)蘇快,性狀穩(wěn)定。
2.2 彎曲菌于低溫(-70°C)條件下存活檢查
各種彎曲菌在布氏血瓊脂中,經(jīng)10代以目上傳代穩(wěn)定后,一般在混合氣體條件下,于37°C經(jīng)24h~48h培養(yǎng)后,均能見到較為豐富的生長,經(jīng)涂片作0.3%復(fù)紅單染色,鏡檢一般均能見到生長典型的彎曲菌,然后用Eppendorff離心管加1ml20%小牛血清布氏肉湯(或全羊血),將培養(yǎng)物用白金耳直接刮到小管內(nèi),形成濃厚的菌液,以后將小管在-20°C中預(yù)凍,次日再保存在-70°C中,經(jīng)不同時間檢查存活情況,結(jié)果如表2?梢娫3~10個月內(nèi)于-70°C條件下,全部存活,以上保存方法簡便,易行,可作為彎曲菌保存。
表2 各種彎曲菌經(jīng)-70°C低溫保存后檢查
菌株 | 存活情況 | 菌形檢查 | |||||||
7D | 15D | 1月 | 2月 | 3月 | 6月 | 10月 | |||
人源株 | 11/11 | 11/11 | 11/11 | 11/11 | 11/11 | 11/11 | 11/11 | 典型quanxiangyun.cn/shiti/海鷗翅樣或弧形彎曲菌,極少數(shù)作球狀 | |
C.jejuni雞 | 8/8 | 8/8 | 8/8 | 8/8 | 8/8 | 8/8 | 8/8 | ||
空腸鴨 | 6/6 | 6/6 | 6/6 | 6/6 | 6/6 | 6/6 | 6/6 | ||
彎曲菌鵝 | 4/4 | 4/4 | 4/4 | 4/4 | 4/4 | 4/4 | 4/4 | ||
豬 | 2/2 | 2/2 | 2/2 | 2/2 | 2/2 | 2/2 | 2/2 | ||
羊 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | ||
H.pylori胃炎及幽門彎曲菌潰瘍病患者 | 15/15 | 15/15 | 15/15 | 15/15 | 15/15 | 經(jīng)分離傳代可見40%~95%典型彎曲菌,有的作小球狀 | |||
對照組 | 空腸彎曲菌 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 菌形較典型的彎曲狀 |
結(jié)腸彎曲菌 | 2/2 | 2/2 | 2/2 | 2/2 | 2/2 | 2/2 | 2/2 | ||
C.coli | |||||||||
海鷗彎曲菌 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | ||
C.laridis |
2.3 經(jīng)傳代冷凍保存后,彎曲菌染色體DNA酶切圖譜檢測
2.3.1 空腸彎曲菌染色體DNA酶切 實(shí)驗(yàn)分兩步進(jìn)行 ①取空腸彎曲菌E3、E4(鵝源菌),G891(雞源菌),流羊27(羊源菌)的染色體DNA,分別用三種內(nèi)切酶進(jìn)行消解(HindⅢ、PstⅠXbaⅠ)各管于37°C水浴中,作用1.5h,然后進(jìn)行電泳,電泳在穩(wěn)壓下進(jìn)行,電壓為50V,電泳完畢后將瓊脂糖凝膠(E.B加在凝膠中)置紫外燈下觀察,并照像。②經(jīng)初步試驗(yàn)后,又取適宜的PstⅠ進(jìn)行消解,獲得前后對比較好的結(jié)果。
2.3.2 幽門螺桿菌染色體DNA酶切 幽門螺桿菌自三種不同胃病患者的胃粘膜中分離,Cp397(慢性胃炎、潰瘍病),Cp400(十二脂腸球潰瘍),Cp407(淺表萎縮性胃炎),提取染色體DNA后,用Bg1Ⅱ進(jìn)行酶解,各管于37°C水浴中,作用2.5h電泳40V.2h后30V17h,電泳后將瓊脂糖凝膠(E.B加在凝膠中)置紫外燈下觀察照像?梢钥闯鲇肏indⅢPstⅠey XbaⅠ對不同彎曲菌酶切圖譜有所不同,但其中以PstⅠ酶切的帶型較清晰,還可看到四株不同來源的空腸彎曲菌及三株幽門螺桿菌,在較為長期保存后,染色體DNA酶切圖譜帶型完全一致。
3 討論
彎曲菌菌種保存,對于深入開展對本菌的研究,有著非常重要的意義,文獻(xiàn)上介紹的方法不多,幽門螺桿菌用全血或加20%小牛血清布氏湯或加入各種添加劑進(jìn)行保存,但時間均不太長,Drum等用10%小牛血清布氏湯液體培養(yǎng)物,經(jīng)24h培養(yǎng)后,添加50%甘油及小牛血清,于-70°C中能存活6個月;空腸彎曲菌用50%卵黃鹽水,使用時,接種一白金耳菌苔,置微氧罐內(nèi),增殖24h,換上橡皮塞,置35°C溫箱中,可保存5個月之久,在布氏肉湯內(nèi)于-20°C中可存活2個月;15%甘油布氏肉湯中,在-70°C中可存活半年,但以上方法所保存的菌株,均不能獲得完全存活;而我們所用的10%的小牛血清布氏肉湯,將24h~48h的新鮮菌苔,直接刮到保存的Eppendorff離心小管中,每管加培養(yǎng)基1ml,不需重新培養(yǎng),可直接置-20°C中預(yù)凍,過夜后,再于-70°C中作長期保存,細(xì)菌染色體DNA限制性內(nèi)切酶分析,可應(yīng)用于流行病學(xué)調(diào)查及菌型的鑒定,同型的菌株應(yīng)該有完全相同的染色體DNA酶譜;實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)這種方法對彎曲菌保存后、其生物學(xué)特性及染色體DNA酶切圖譜的檢查,均獲得性狀的前后一致,因此,這是一種比較簡易可行的保藏方法,但對更為長期的保存,仍需作進(jìn)一步的研究