本品系用從健康人白細(xì)胞中獲得的α1b干擾素基因重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染大腸桿菌，使之高效表達(dá)人α1b干擾素，經(jīng)高度純化后凍干制成。用于治療慢性乙型肝炎、丙型肝炎和毛細(xì)胞白血病等疾病。
1 菌種
1.1菌種來源
系帶有人α1b干擾素基因的pBVXα1b質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM103株。投產(chǎn)的工程菌需經(jīng)衛(wèi)生部批準(zhǔn)。
1.2菌種特性
菌種表達(dá)穩(wěn)定，表達(dá)水平符合投產(chǎn)菌種要求。
1.3制造用菌種庫的建立
從原始菌種庫傳出，經(jīng)擴(kuò)大后凍干保存，或由上一代制造用菌種庫傳出，擴(kuò)大后凍干保存作為制造用菌種庫，但每次只限傳三代。每批制造用菌種庫均應(yīng)進(jìn)行下列檢定，合格后方可投產(chǎn)。
1.3.1劃種LB瓊脂平板
應(yīng)呈典型大腸桿菌集落形態(tài)，無其他雜菌生長。
1.3.2涂片革蘭氏染色
在光學(xué)顯微鏡下觀察應(yīng)為典型的革蘭氏陰性桿菌。
1quanxiangyun.cn/pharm/.3.3對抗生素的抗性
應(yīng)與原始菌種相符。
1.3.4電鏡檢查
應(yīng)為典型大腸桿菌形態(tài)，排除支原體、病毒樣顆粒及其他微生物污染。
1.3.5生化反應(yīng)
應(yīng)符合大腸桿菌生物學(xué)性狀。
1.3.6干擾素表達(dá)量
在搖床中培養(yǎng)，應(yīng)符合原始菌種的表達(dá)量。
1.3.7表達(dá)的干擾素型別
應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)抗α型干擾素血清作中和試驗(yàn)，證明型別無誤。
1.3.8質(zhì)粒檢查
應(yīng)做該質(zhì)粒的酶切圖譜，應(yīng)與原始質(zhì)粒相符。
1.4種子液制備
1.4.1菌種傳代用LB培養(yǎng)基
液體LB培養(yǎng)基不含瓊脂，供搖床培養(yǎng)用，含2%瓊脂供制備平板和斜面用，含0.5%瓊脂的半固體供短期保存菌種用。
1.4.2生產(chǎn)菌種的制備和檢定
取制造用菌種庫凍干菌種，開啟后劃種培養(yǎng)基平板2～3塊，培養(yǎng)后挑取平板中典型集落8～10個(gè)，分別培養(yǎng)后保存，然后分別進(jìn)行干擾素表達(dá)量測定，至少重復(fù)一次，先其中干擾素表達(dá)量最高的一份供生產(chǎn)制備種子液用，其表達(dá)量應(yīng)符合原始菌種庫的表達(dá)量，所表達(dá)的干擾素應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)抗α型干擾素血清作中和試驗(yàn)，證明型別無誤。
1.4.3種子液的制備
將菌種接種M9CA培養(yǎng)基，在搖床中培養(yǎng)至OD值在0.4～0.8之間即可供發(fā)酵罐接種用。種子液應(yīng)進(jìn)行質(zhì)粒穩(wěn)定性檢查。
2 發(fā)酵
2.1每次發(fā)酵前必須進(jìn)行一次空罐滅菌。
2.2發(fā)酵用GMD培養(yǎng)基，用蒸餾水配制，其中不含有任何抗生素，配制后進(jìn)行實(shí)罐滅菌。
2.3發(fā)酵溫度為36.5±0.1℃，根據(jù)工程菌生長情況到后期可適當(dāng)調(diào)整溫度，并作必要的培養(yǎng)基成分添加，發(fā)酵時(shí)間根據(jù)工程菌生長情況確定。發(fā)酵結(jié)束時(shí)放出菌液，發(fā)酵灌應(yīng)再進(jìn)行一次滅菌并清洗。
3 收菌
用離心法收取菌體，稱重，容器上標(biāo)明批號、罐別、重量、日期。收獲的菌體如在24小時(shí)內(nèi)破菌裂解可保存于4～8℃冷庫，否則應(yīng)置?/FONT>30℃凍存。
4 菌體裂解與粗制干擾素制備
用高壓勻漿法裂解菌體，將菌體作成10%～20%的懸液進(jìn)行高壓勻漿，壓力50Mpa/cm2，連續(xù)勻漿二次，勻漿后的懸液離心后取上清即為粗制干擾素。
5 濃縮與純化
5.1初步純化
采用不同原理多步驟的方法，使初步純化的干擾素達(dá)到外觀無色透明，無絮狀物，比活性在105IU/mg蛋白以上，并將其濃縮至原體積的1/10～1/20，保存于4℃，如3天內(nèi)不能進(jìn)行高度純化，應(yīng)凍存于?/FONT>30℃冰箱內(nèi)。
5.2高度純化
經(jīng)初步純化后進(jìn)行高度純化，去除絕大部分非干擾素蛋白，使其達(dá)到本規(guī)程7～8項(xiàng)要求。高度純化應(yīng)在潔凈度為10000級的恒溫（15～18℃)室內(nèi)進(jìn)行。
5.3在高度純化過程中應(yīng)進(jìn)一步濃縮，使體積為初步純化干擾素的1/5～1/10。并應(yīng)轉(zhuǎn)換緩沖液系統(tǒng)，使之適合于人體注射用。
5.4在整個(gè)濃縮與純化過程中不得加入對人體有害的物質(zhì)。
5.5在濃縮純化過程中應(yīng)特別注意去除熱原質(zhì)，用于分子篩層析的溶液，配合后應(yīng)進(jìn)行去除熱原質(zhì)處理。容器應(yīng)干熱滅菌，不能干熱滅菌者應(yīng)用適當(dāng)濃度的NaOH處理。
5.6濃縮純化最后所得的純化干擾素即為“半成品原液”，取樣進(jìn)行7.1～7.4項(xiàng)檢定后，立即加入人白蛋白，使其最終含量為2%，稱為“加白蛋白半成品”，取樣測定干擾素效價(jià)，其余凍存于－30℃冰箱中，應(yīng)盡量避免凍融。
5.7所用的人白蛋白應(yīng)符合相應(yīng)規(guī)程要求，HBsAg。
6 稀釋、除菌過濾
6.1將檢定合格的加白蛋白半成品以乳徑為0.22μm的濾膜除菌過濾，除菌后立即進(jìn)行稀釋。
6.2稀釋液制備
用合格的蒸餾配制生理鹽水，經(jīng)高壓滅菌，加入檢定合格的注射用人白蛋白，使最終含量為2%，即為稀釋液。配制后應(yīng)立即用于稀釋。
6.3稀釋
除菌后加白蛋白半成品用稀釋液稀釋至所需濃度。稀釋后用孔徑為0.22μm濾膜過濾除菌，保存于4℃，并取樣作無菌試驗(yàn)和熱原試驗(yàn)，合格后進(jìn)行凍干。
7 半成品檢定
每批半成品抽樣進(jìn)行7.1～7.7項(xiàng)檢定。啟開新菌種生產(chǎn)的前3批或生產(chǎn)條件有較大改變時(shí)進(jìn)行7.8～7.12項(xiàng)檢定。
7.1效價(jià)測定
用細(xì)胞病變抑制法，Wish細(xì)胞/VSV為檢測系統(tǒng)。用國家參考品校準(zhǔn)為IU。
7.2蛋白含量
用Lowry法測定。同批不同階段的樣品比較時(shí)應(yīng)盡可能同時(shí)測定。
7.3比活性
根據(jù)效價(jià)測定及蛋白含量計(jì)算比活性，本品的比活性應(yīng)在107IU/mg蛋白以上。
7.4純度
7.4.1電泳純度
用非還原型SDS?/FONT>PAGE法，加樣量不低于5μg，經(jīng)掃描儀掃描，純度應(yīng)在95%以上，聚合體不得超過10%。
7.4.2高效液相色譜純度
用280nm檢測，應(yīng)呈一個(gè)吸收峰，或主峰占總面積95%以上。
7.5分子量測定
用還原型SDS?/FONT>PAGE法。加樣量不低于5μg。制品的分子量與理論值比較，誤差不超過10%。
7.6殘余外源性DNA含量
用固相斑點(diǎn)雜效法，以地高辛標(biāo)記的核酸探針法測定，其含量應(yīng)少于100pg/劑量。
7.7殘余IgG含量
如采用單克隆抗體親和層析法純化，應(yīng)進(jìn)行本項(xiàng)檢定。采用ELISA雙抗體夾心法測定，IgG含量應(yīng)少于100ng/劑量。
7.8殘余工程菌蛋白含量
用酶標(biāo)法或其他敏感方法測定，殘余工程菌蛋白不得超過總蛋白的0.02%.
7.9抗生素活性
半成品中不應(yīng)有殘余氨芐青霉素活性。
7.10肽圖測定
應(yīng)符合α1干擾素的圖形，批與批之間圖形應(yīng)一致。
7.11等電聚集
測定等電點(diǎn)，應(yīng)有固定的范圍（4.0～6.5之間)。
7.12紫外光譜掃描
檢查半成品的光譜吸收值，批與批之間應(yīng)一致，應(yīng)有固定的最大吸收值。
8 除菌半成品檢定
8.1效價(jià)測定
同7.1項(xiàng)。
8.2無菌試驗(yàn)
按《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。
8.3熱原質(zhì)試驗(yàn)
按《生物制品熱原質(zhì)試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。每只家兔靜脈注射干擾素5萬，判定標(biāo)準(zhǔn)按該規(guī)程4.1項(xiàng)要求進(jìn)行。
9 成品檢定
9.1處觀
應(yīng)為微黃色薄殼狀疏松體，加入1ml蒸餾水后溶解迅速，不得含有肉眼可見的不溶物。
9.2 pH值
pH值應(yīng)為6.5～7.5。
9.3無菌試驗(yàn)
同8.2項(xiàng)。每批抽樣不少于10支。
9.4水分
應(yīng)≤3%。
9.5熱原質(zhì)試驗(yàn)
同8.3項(xiàng)。
9.6價(jià)測定
同7.1項(xiàng)。效價(jià)應(yīng)為標(biāo)示量的80%～150%。
9.7安全試驗(yàn)
9.7.1豚鼠試驗(yàn)
用體重300～400g豚鼠2只，每只腹側(cè)皮下注quanxiangyun.cn/zhicheng/射1ml（于1ml生理鹽水內(nèi))，觀察7天，豚鼠應(yīng)健存，每只體重增加判為合格。
9.7.2小白鼠試驗(yàn)
用體重18～20g小白鼠5只，每只腹腔注射0.5ml（于0.5ml生理鹽水內(nèi))，觀察7天，動物應(yīng)健存，每只體重增加判為合格。
10規(guī)格
10μg/瓶，20μg/瓶和30μg/瓶。
11保存與效期
保存于2～8℃，自效價(jià)檢定合格之日起效期為2年6個(gè)月。
