血清中膽固醇包括CE和FC，酯型的CE占70%，F(xiàn)C占30%。CE中的C3的-OH在LCAT作用下，可分別結(jié)合亞油酸（43%)、油酸（24%)、軟脂酸（10%)、亞麻油酸（6%)、花生四烯酸（6%)、硬脂酸（3%)等脂肪酸結(jié)合而成。血清中膽固醇在LDL中最多，其次是HDL和VLDL、CM最少。血清總膽固醇測(cè)定方法分為化學(xué)法和酶法兩大類。
1．化學(xué)法
化學(xué)法一般包括：①抽提；②皂化；③毛地黃皂苷沉淀純化；④顯色比色四個(gè)階段。代表性的方法有Sperry-Webb法，通過①～④步驟操作過程。常規(guī)操作中多采用省去了②、③�；蛘哂檬∪ア凇ⅱ鄄襟E的Zak-Henly法及省去③步驟的Abell-Kendall法，現(xiàn)將此法作為標(biāo)準(zhǔn)參考方法予以引用。
2．酵法測(cè)定
CE在膽固醇酯酶（cholesterolesterase)作用下水解成FC和NFFA，TC再經(jīng)膽固醇氧化酶（cholesterol oxidase,COD)氧化成△4膽甾烯酮和H2O2。再分別定量O2的消耗或者H2O2的生成量，或者△4膽甾烯酮生成量,以作為TC的定量依據(jù)。該法是目前常規(guī)的應(yīng)用方法，快速準(zhǔn)確，標(biāo)本用量少，便于自動(dòng)生化分析儀作批量測(cè)定。
1．原理
血清加入醇溶性氫氧化鉀，使膽固醇從脂蛋白中分離出來，同時(shí)使膽固醇酯加水分解成游離膽固醇，加石油醚振搖、抽提，使膽固醇移入石油醚層，分離并取一定量的石油醚層，蒸發(fā)至干，再進(jìn)行Liebermann-Burchard 顯色反應(yīng)，620nm比色定量。該法可用于基本功訓(xùn)練及組織細(xì)胞膽固醇的提取定量。
2．試劑組成
| 代號(hào) | 種類 | 濃度 | 組 成 | 貯存2～8℃ | 有效時(shí)間 |
| R1 | 乙醇 | 優(yōu)質(zhì)純 | |||
| R2 | 石油醚 | 沸點(diǎn)68℃，特級(jí)純 | |||
| R3 | 水醋酸 | 分析純 | |||
| R4 | 無水醋酸 | 膽固醇分析用，不含HCI | |||
| R5 | 濃硫酸 | 分析純 | |||
| R6 | KOH液 | 33%(W/W) | KOH10g+H2O20ml | ||
| R7 | 乙醇性KOH液 | R194ml+R66ml | 臨用前配制 | ||
| R8 | Liebermann | 配制后 | |||
| Burchard | R420體積+R51體積+R310體積 | 1h | |||
| 試劑* | 內(nèi)用完quanxiangyun.cn/shouyi/ | ||||
| R9 | 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液 | 5.17mmol/L | 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品200mg+R1→100ml | 0 |
*：在三角燒瓶?jī)?nèi)，加入無水醋酸，于冰水中冷至10℃以下，再慢慢加入濃硫酸，混合，靜置10min，又加冰醋酸混勻，備用。
3．操作
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圖15-1 血清膽固醇（Abell法)測(cè)定操作圖
按圖15-1操作。
4．計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)總膽固醇濃度=ESA/EST×5.17(mmol/L)
首先將血清中膽固醇酯在膽固醇酯酶（CEH)水解為游離膽固醇和脂肪酸，膽固醇在膽固醇氧化酶（COD)作用下，生成△4-膽甾烯酮和H2O2，再H2O2經(jīng)過氧化物酶（POD)作用在4-氨基安替比林（4-AA-P)及N-乙基-N-（3-磺基醋酸)-3甲氧基苯胺（N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidine,ESPAS)參與下，生成紅色醌亞胺色素。
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H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林→紅色醌亞胺色素
（一)手工測(cè)定法
1．試劑組成
| 代號(hào) | 種類 | 濃度 | 組成 | 貯2～8℃ | 有效時(shí)間 |
| Na2HPO4 | 50mmol/L | ||||
| Na2H2PO4 | 50mmol/L | ||||
| 膽酸鈉 | 3mmol/L | ||||
| 4-氨基安替比林 | 0.82mmol/L | ||||
| R1* | ESPAS | 14mmol/L | 24h | ||
| Carbowax-6000 | 0.17mmol/L | ||||
| CEH | 33U/L | ||||
| COD | 117U/L | ||||
| POD | 6700U/L | ||||
| R2 | 標(biāo)準(zhǔn)液 | 5.17mmol/L | 用異丙醇溶解膽固醇 |
*混勻，調(diào)pH至6.70±0.10(25℃)，或購(gòu)買試劑盒。酶以活性單位表示。
2．操作
按圖15-2操作。
3．計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)總膽固醇濃度=ESA/EST×5.17(mmol/L)
（二)自動(dòng)化分析儀測(cè)定
以CL-7200型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)為例。
1．試劑組成
A液：CEH、POwww.med126.comD、抗壞血酸氧化酶等。
B液：COD、4-氨基安替比林等。
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圖15-2 血清膽固醇測(cè)定（酶法)操作圖
2．上機(jī)參數(shù)
| 項(xiàng) 目 | 參 數(shù) |
| 方 法 | 終點(diǎn)法 |
| 波 長(zhǎng) | 雙波長(zhǎng)（540nm，700nm) |
| 反應(yīng)溫度 | 37℃ |
| 試劑A反應(yīng)時(shí)間 | 2～3min |
| 試劑B反應(yīng)時(shí)間 | 5～6min |
| 樣本用量 | 3μl |
| 試劑A用量 | 250μl |
| 試劑B用量 | 120μl |
| 單位 | mmol/L |
3．操作過程
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4．計(jì)算
以△A=A2-A1，根據(jù)同樣處理之標(biāo)準(zhǔn)或質(zhì)控物計(jì)算，打印結(jié)果。
5．注意事項(xiàng)
（1)試劑與樣本量可根據(jù)分析儀要求按比例改變。
（2)試劑在有效內(nèi)2～8℃避光食保存。
（3)膽固醇含量超過200mmol/L，需用生理鹽水稀釋再測(cè)。
