一、血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)
血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)常用的方法有貼塊法（explant)和酶解離法（enzyme disperse)。貼塊法具有獲得平滑肌細(xì)胞純度高，量多，操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。但用貼塊法易使平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)肌絲喪失，亞細(xì)胞器增加。相反，酶解離法，由于酶的作用使細(xì)胞間失去連接，細(xì)胞內(nèi)肌絲含量豐富，保持收縮型狀態(tài)。培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞常取材于兔、豬、鼠、猴的胸腹主動(dòng)脈段。
1．
方法：動(dòng)物經(jīng)頸動(dòng)脈放血后，在無(wú)菌操作下迅速取出胸腹主動(dòng)脈段，置于含Hank"s液的平皿中漂洗3次，將凝塊洗干凈后剝除外膜的纖維脂肪層，然后縱行切開(kāi)血管，刮除內(nèi)膜即內(nèi)皮細(xì)胞迅速撕下中膜內(nèi)、中層，切成約1mm寬的小條，浸泡在含血清的Hank"s液中，并將撕下小組織塊種植于培養(yǎng)瓶壁。置于37℃恒溫箱，2h左右，取出培養(yǎng)瓶加入20%胎牛血清的培養(yǎng)液，再放回培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)4天。4天后可見(jiàn)細(xì)胞從組織中遷移游出。
不同動(dòng)物血管結(jié)構(gòu)有差異，豬和猴較易操作，但小動(dòng)物如兔、鼠因其血管小，血管壁薄等特點(diǎn)，使之難以分離。另外組織塊太薄，不易粘附培養(yǎng)基，也使細(xì)胞較難生長(zhǎng)。為了保證培養(yǎng)的成功，應(yīng)注意：①種植組織塊的數(shù)目，如75cm2的長(zhǎng)頸瓶組織塊不得少于30個(gè)；②根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的種屬加入適量的不同血清，一般可加入牛血清，若小牛血清增殖效果差，應(yīng)加胎牛血清（FBS)，通常濃度為10%～20%；③培養(yǎng)基的選擇：常用的有DMEM（Dulbecco"s modified Eagles"medium)，M199培養(yǎng)基。培養(yǎng)兔的平滑肌細(xì)胞用DMEM效果較好。
2．酶解離法
沿動(dòng)脈縱軸切開(kāi)后，刮除內(nèi)皮細(xì)胞撕下中膜的內(nèi)2/3，注意不要混入內(nèi)皮細(xì)胞，將組織塊切成1-2mm2，放入加有3mg/ml膠原酶的無(wú)血清M199培養(yǎng)基中，37℃，0.5～1.5h。離心去上清，重復(fù)上述消化步驟，然后再離心（9000r,4min)，收集細(xì)胞，在5%～10%同種血清或胎牛血清的M199培養(yǎng)基中調(diào)整細(xì)胞數(shù)，然后轉(zhuǎn)入30～90mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，對(duì)于兔子應(yīng)加入高濃度的谷氨酰胺（0.2g/L)較佳。不同研究者在培養(yǎng)基、酶濃度以及消化時(shí)間等的選擇都有很大的差異。
二、動(dòng)脈平滑肌的特性
由于貼塊法和解離法處理方式不同，在細(xì)胞培養(yǎng)的最初階段細(xì)胞形態(tài)和性質(zhì)存在差異。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)環(huán)境趨于一致，細(xì)胞特性上也趨于近似。
光學(xué)倒置顯微鏡下觀察：原代平滑肌細(xì)胞形狀多樣，一般常為梭形、帶形、三角形或星形。貼塊法培養(yǎng)，細(xì)胞可于2周后長(zhǎng)成單層；而酶解離只需6～7天，鏡下可見(jiàn)明顯“峰-谷”樣生長(zhǎng)。
透射電子顯微鏡下觀察：貼塊法，細(xì)胞多為合成型，肌絲減少，胞體縮小，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體、線粒體等亞細(xì)胞器逐漸增多。消化法，細(xì)胞初期表現(xiàn)為收縮型，細(xì)胞內(nèi)核位于中心，胞質(zhì)內(nèi)含豐富的肌絲及致密度體。亞細(xì)胞器少，且位于細(xì)胞邊緣處，基底膜最初未見(jiàn)，后來(lái)逐漸形成。傳代后，細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)為合成型，胞體增大且變扁平，核增大，核小體數(shù)目增加，亞細(xì)胞器也增加，肌絲開(kāi)始減少，占胞內(nèi)35.4%～11.5%,甚至更少。quanxiangyun.cn/kuaiji/
另外，在體外實(shí)驗(yàn)中，來(lái)自幼齡動(dòng)物（兔，豬)的血管平滑肌增殖生長(zhǎng)早且快，相反，老齡動(dòng)物則生長(zhǎng)緩慢。在生化性質(zhì)方面，收縮型細(xì)胞比合成型細(xì)胞的β-極密度脂蛋白（β-VLDL)對(duì)其受體結(jié)合能力強(qiáng)，低密度www.med126.com脂蛋白（LDL)分解降低，即脂質(zhì)容易在胞質(zhì)沉著。此外，像基底膜中的肝素樣物質(zhì)、膽固醇代謝等也有改變。合成型細(xì)胞內(nèi)色素C氧化還原酶成倍增加，酸性磷酸酶亦呈3～4倍增加，說(shuō)明這兩類細(xì)胞不僅在形態(tài)學(xué)上，在生化、生理反應(yīng)方面也發(fā)生了較大改變。
