采用CPE(細(xì)胞致病效應(yīng))抑制為基礎(chǔ)的抑制微量測定法,以每ml干擾素檢品的最高稀釋度仍能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞(50)免受病毒攻擊的稀釋度的倒數(shù)定為干擾素單位。以國際單位(IU)表示,并用國家標(biāo)準(zhǔn)品校正結(jié)果。
1 細(xì)胞培養(yǎng)
將新鮮傳代24~48小時(shí)的Wish細(xì)胞(人羊膜細(xì)胞)以約35萬/ml的濃度另入96孔組織培養(yǎng)板上,每孔100μl,置37℃5%CO2孵箱中培養(yǎng)4~6小時(shí)。
2 樣品稀釋與細(xì)胞混合
干擾素檢品做4倍系列稀釋,每份檢品做6個(gè)稀釋度(如100萬單位,則測4-12~4-7)每個(gè)稀釋度加2孔,與培養(yǎng)板中的細(xì)胞等量混合,置37℃5%CO25%CO2孵箱培養(yǎng)18~24小時(shí)。
3 加病毒
倒掉培養(yǎng)板中的上清液,以100CCID50quanxiangyun.cn/job//ml的濃度加入VSV(水泡性口腔炎病毒),每孔100μl,37℃5%CO2孵箱培養(yǎng)24小時(shí)左右。
4 觀察結(jié)果
顯微鏡下觀察細(xì)胞病變,若病毒對照各孔細(xì)胞出現(xiàn)75%~1000%的明顯病變和死亡(變圓、死亡、脫落(,而細(xì)胞對照組中的細(xì)胞仍生長良好(病變=0),則表明對照系統(tǒng)合格,結(jié)果成立。
5 計(jì)算
通?砂碦eed?/FONT>Muench法計(jì)算,其步驟如下:
(1)計(jì)算保護(hù)百分比
quanxiangyun.cn/shiti/稀釋度 | 病變平均值(每孔) | 正常平均值(每孔) | 累積數(shù) | 比例 | 百分比(%) | |
病變 | 正常 | 正常/病變+正常 | ||||
4-1 | 0 | 4 | 0 | 13 | 13/13 | 100 |
4-2 | 0 | 3 | 0 | 9 | 9/9 | 100 |
4-3 | 1 | 2 | 1 | 5 | 5/6 | 83 |
4-4 | 2 | 2 | 3 | 2 | 2/5 | 40 |
4-5 | 4 | 0 | 7 | 0 | - | - |
4-6 | 4 | 0 | 11 | 0 | - | - |
(2)求出干擾素單位
距離比=(·高于50%的百分?jǐn)?shù)-50)/(高于50%的百分?jǐn)?shù)-低分50%百分?jǐn)?shù))=(83-50)/(83-40)=33/43=0.77
即此批干擾素稀釋到4-3。77(1∶186)時(shí)能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞免受攻擊病毒損害。此批干擾素效價(jià)為186單位,經(jīng)國家標(biāo)準(zhǔn)品修正,得出干擾素的國際單位(以IU表示)。