胃腸道T淋巴細(xì)胞分布在上皮層、固有層、粘膜集合和散在淋巴濾泡及腸系膜淋巴結(jié)內(nèi)。隨著免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用和各類(lèi)T細(xì)胞亞群?jiǎn)慰寺?a href="http://quanxiangyun.cn/yaoshi/" target="_blank">quanxiangyun.cn/yaoshi/抗體的制備成功，為進(jìn)一步研究不同部位T淋巴細(xì)胞的分類(lèi)和功能起極其重要的作用。
1．上皮內(nèi)T淋巴細(xì)胞上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞（intraepithelial lymphocyte, IEL)是指位于上皮層基底部的T淋巴細(xì)胞。近年來(lái)，對(duì)IEL對(duì)鄰近上皮細(xì)胞有壓跡，位于兩個(gè)上皮細(xì)胞交界處，并未進(jìn)入上皮細(xì)胞內(nèi)。近年來(lái)，對(duì)IEL研究非常深入。已經(jīng)證實(shí)75%以上成人小腸IEL是TCRγαβ陽(yáng)性細(xì)胞，說(shuō)明它們來(lái)源于胸腺，接受過(guò)抗原刺激。其中大部分為誘導(dǎo)、殺傷性T淋巴細(xì)胞（CD8或OKT8陽(yáng)性)，10%左右為CD7陽(yáng)性和CD3陰性的IEL，類(lèi)似NK細(xì)胞，有細(xì)胞毒作用，但無(wú)NK細(xì)胞標(biāo)記，對(duì)NK的靶細(xì)胞無(wú)破壞作用。10%～20%左右為T(mén)CRδ陽(yáng)性IEL，不受胸腺的影響，其中70%CD4和CD8均陰性，為T(mén)淋巴細(xì)胞前體。說(shuō)明人的部分IEL通過(guò)胸腺外途徑進(jìn)行分化。內(nèi)毒素等腔內(nèi)抗原與腸上皮細(xì)胞微絨毛、腸腺隱窩細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞膜上的組織相關(guān)性抗原分子（鼠為MHL-II，人為HLA-DR、HLA-DP和HAL-DR)相結(jié)合后，將抗原分子傳遞到CD3陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞受體（t lymphocyte receptor, TCR)中的α和β亞單位可變區(qū)進(jìn)行結(jié)合，在CD8分子作用下導(dǎo)致IEL增殖和分泌大量γ-干擾素（γ-INF)，α-腫瘤壞死因子（α-TNF)，和少量的白介素-2（IL-2)，發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，調(diào)節(jié) 上皮細(xì)胞再生和增強(qiáng)對(duì)食物抗原的耐受。
2．固有層T淋巴細(xì)胞固有層T淋巴細(xì)胞（lamina propria lyphocyte, LPL)分散在固有層，約占固有層免疫細(xì)胞總數(shù)10%左右。其中CD4陽(yáng)性細(xì)胞（CD4LPL)顯著多于CD8陽(yáng)性細(xì)胞（CD8LPL)。40%CD4LPL表達(dá)CD45RO抗原，能產(chǎn)生大量IL-2、IL-4和γ-INF，為記憶性T淋巴細(xì)胞，能輔助B細(xì)胞轉(zhuǎn)化成抗體產(chǎn)生細(xì)胞并促其分泌抗體。60%CDquanxiangyun.cn/jianyan/4LPL表達(dá)CD45RA和CD8抗原，能直接抑制抗體產(chǎn)生細(xì)胞轉(zhuǎn)化和分泌。這兩種細(xì)胞的比例在調(diào)節(jié) 抗體分泌中起著重要作用。CD8LPL也可以分兩種：一種表達(dá)CD28抗原的LPL，能通過(guò)ADCC或直接溶解靶細(xì)胞。另一種表達(dá)CD16抗原，具有自然殺傷功能。LPL能被IL-2激活，激活的LPL能釋放大量IL-2、IL-4、γ-INF和IL-5、IL-2又能激活LPL，起著自身分泌作用。IL-5能促進(jìn)抗體產(chǎn)生細(xì)胞分泌抗體。
3．胃腸道相關(guān)淋巴組織T淋巴細(xì)胞胃腸道相關(guān)淋巴樣組織（gut – associated lymphoid tissue,GALT)主要包括腸系膜淋巴結(jié)和粘膜中集合和散在淋巴濾泡。GALTT淋巴細(xì)胞多們于生發(fā)中心的外周部位，約占40%。其中CD8和CD4陽(yáng)細(xì)胞比例與周?chē)嗨�。�?dòng)物研究證明，腸系膜淋巴結(jié)內(nèi)的CD4陽(yáng)民生細(xì)胞多于固有層。分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)GALTT淋巴細(xì)胞含有IL-4和IL-5基因，激活后產(chǎn)生大量IL-4和IL-5，能特異性增加B和T淋巴細(xì)胞增殖。抑制B淋巴細(xì)胞分化。其表面糖蛋白主要為CD45RA和leu8(CD8)，證明是幼稚T淋巴細(xì)胞。它們對(duì)抗原刺激的增殖反應(yīng)低，對(duì)刀豆素A等有絲分裂促進(jìn)劑的增殖反應(yīng)高，產(chǎn)生IL-2和γ-INF低，輔助作用弱。GALTT淋巴細(xì)胞如何調(diào)節(jié) B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化成IgA產(chǎn)生細(xì)胞和其它免疫細(xì)胞的增殖及功能，并不十分清楚。有待進(jìn)一步研究。
近年研究發(fā)現(xiàn)，除M細(xì)胞和巨噬細(xì)胞外，胃腸上皮細(xì)胞在接受和傳遞抗原中也起重要作用。免疫細(xì)胞化學(xué)發(fā)現(xiàn)正常小腸上皮細(xì)胞微絨毛和側(cè)膜有斑片狀MHc II類(lèi)抗原，人小腸為HLA-DR糖蛋白，能識(shí)別、加工和傳遞抗原使粘膜內(nèi)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)。HLA-DR表達(dá)受γ-IFN誘導(dǎo)。因此免疫反應(yīng)中組織相關(guān)性抗原與IEL和LPL淋巴細(xì)胞互相進(jìn)行調(diào)節(jié) 。
1．組織切片中T淋巴細(xì)胞80年代以前多用玫瑰花瓣試驗(yàn)和酸性酯酶方法進(jìn)行組織切片中T淋巴細(xì)胞研究，特異性較差。近年來(lái)多用OKT，Leu或CD等系列T淋巴細(xì)胞單克隆抗體進(jìn)行研究，特異性高，可以分類(lèi)出各種亞群。免疫組化染色中應(yīng)注意以下幾個(gè)方面：
（1)抗體的選擇：根據(jù)不同目的選擇相應(yīng)的抗體，如要對(duì)人胃腸道組織進(jìn)行研究，可選用OKT系統(tǒng)單抗；對(duì)鼠類(lèi)等進(jìn)行研究可選用Leu 或Thy系列。如要研究輔助性T淋巴細(xì)胞可用OKT4或CD4；研究抑制性T淋巴細(xì)胞可用OKT8或CD8等單克隆抗體。
（2)組織加工方法選擇：目前所研究的特異性T淋巴細(xì)胞抗原決定簇多位于細(xì)胞膜上，用陳舊或普通組織固定和加工方法可能使抗原破壞，應(yīng)采用新鮮組織和低溫處理。具體方法是：手術(shù)或活檢獲得的組織立即用液氮冷凍，或用OCT復(fù)合物包埋后再放入液氮中，便于切片，Cryostat冰凍切片后室溫下風(fēng)干，用4℃純乙醇或丙酮固定10min，PBS沖洗后即可進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。
（3)染色方法的選擇：因抗原較微量，而且位于細(xì)胞膜，應(yīng)采取敏感性強(qiáng)、特異性高、非特異性著色少的方法。雖然有報(bào)道采用間接熒光或間接酶標(biāo)技術(shù)也能顯示特異性T淋巴細(xì)胞，我們推薦最好采用PAP或ABC染色技術(shù)。具體方法參閱第三，四章 。
2．粘膜分離液中T淋巴細(xì)胞一定重量粘膜組織中分離出來(lái)的T淋巴細(xì)胞也可以用免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行定量和定性研究。下面介紹用間接免疫熒光技術(shù)研究IEL的大致過(guò)程：
（1)將手術(shù)取得的腸管縱形剪開(kāi)，將上皮層與固有層分離。
（2)上皮層放在無(wú)鎂離子、含100U青霉素和鏈霉素及0.2%疊氮納的PB中清洗，無(wú)血液和其它雜質(zhì)后用解剖剪將組織剪碎，用勻漿器磨碎或用超聲粉碎或用膠原酶溶解上皮細(xì)胞。
（3)勻漿液通過(guò)脫脂棉、尼龍篩（只允許淋巴細(xì)胞濾過(guò)，除去粘液、碎屑和上皮細(xì)胞凝集塊)或金屬網(wǎng)（200目)獲得淋巴細(xì)胞懸液。
（4)將硅化玻璃球高壓消毒，沖洗和平衡后將懸浮液過(guò)柱，得到的細(xì)胞液直接計(jì)數(shù)。也可以用淋巴細(xì)胞分離液提取，用臺(tái)盼藍(lán)測(cè)定其活性，并加10%FCS-RPMI細(xì)胞培養(yǎng)液，淋巴細(xì)胞數(shù)應(yīng)達(dá)5×106/ml。
（5)試管內(nèi)加0.1ml細(xì)胞液后加OKT系列單抗0.1ml，同時(shí)用另一試管加0.1mlPBS作對(duì)照�；旌弦涸�4℃放置30～60min（也可以在冰箱過(guò)夜)后，PBS（含RPMI)沖洗3次，離心后細(xì)胞沉淀物再加PBS至0.1ml。
（6)加0.1mlFITC標(biāo)記的抗鼠IgG（根據(jù)工作效價(jià))，4℃放置20～30min，PBS洗3次，離心后加在紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，熒光顯微鏡觀察。
（7)陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞膜上有綠色熒光，有的呈顆粒樣，隨細(xì)胞滾動(dòng)。熒光鏡下可計(jì)算200個(gè)淋巴細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分率，或根據(jù)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中陽(yáng)性細(xì)胞算出細(xì)胞總數(shù)及百分率。
1．IEL在胃腸道粘膜中起重要免疫屏障作用正常成人空腸100個(gè)上皮細(xì)胞有20個(gè)IEL，回腸有13個(gè)，結(jié)腸只有5個(gè)，這也可能是惡性腫瘤不發(fā)生在小腸的重要因素之一。我們發(fā)現(xiàn)胃粘膜也有IEL。在胃部炎癥和潰瘍時(shí)，上皮及腺體隱窩細(xì)胞間的IEL明顯增加。IEL不但參與免疫反應(yīng)，而且通過(guò)偽足與上皮細(xì)胞接觸，加速上皮細(xì)胞再生。電鏡下胃粘膜也發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象。IEL與乳糜瀉（coeliac disease, CD)關(guān)系最密切。近期研究表明，第12型腺病毒與麥膠蛋白有同源性。CD病人腸道感染這種病毒后，服用麥膠數(shù)小時(shí)粘膜中IEL顯著增加。在上皮細(xì)胞HLAII抗原糖蛋白分子作用下與TCR結(jié)合，激活TCRαβlEL，發(fā)揮細(xì)胞毒作用，導(dǎo)致腸粘膜萎縮，引起脂肪吸收不良和腹瀉等一系列臨床癥狀。增加的TCRγδIEL調(diào)節(jié) TCRαβ的殺傷作用。停服含麥膠食物后，TCRαβIEL明顯減少，上皮細(xì)胞再生恢復(fù)，臨床癥狀消失。CD病人出現(xiàn)疣狀胃炎也是IEL參與的免疫反應(yīng)結(jié)果。CD病人的腸道淋巴瘤也是來(lái)自IEL增殖。器官移植后的宿主排異反應(yīng)、結(jié)腸炎、熱帶性腹瀉、牛奶過(guò)敏和某些自身免疫性疾病均有IEL增加。也有人發(fā)現(xiàn)克隆氏病和潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸IEL細(xì)胞毒性作用明顯減弱。當(dāng)然，IEL增加是繼發(fā)或是原發(fā)，是否IEL是這些疾病的病因，臨床治療和診斷價(jià)值如何，還不清楚。而且IEL受年齡、抗原、免疫調(diào)節(jié) 劑（考的松對(duì)IEL無(wú)影響，環(huán)磷酰胺顯著降低IEL數(shù)量)等因素影響，因此需要深入進(jìn)行研究。
2．粘膜固有層T淋巴細(xì)胞在局部體液免疫中起重要調(diào)節(jié) 作用在GALT中有開(kāi)關(guān)性T淋巴細(xì)胞使生發(fā)中心的淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化成IgA產(chǎn)生細(xì)胞。這些細(xì)胞減少或功能缺乏可導(dǎo)致免疫球蛋白A缺乏。有人分離出克隆氏病和潰瘍性結(jié)腸炎病人固有層T淋巴細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)輔助性T淋巴細(xì)胞減少，抑制性T淋巴細(xì)胞顯著增加，可能導(dǎo)致局部免疫失調(diào)，引起細(xì)胞毒性或遲發(fā)性過(guò)敏反應(yīng)等，致使炎癥和潰瘍發(fā)生。
3．胃腸道腫瘤細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞研究倍受重視我們及國(guó)內(nèi)外一些報(bào)道均證明胃癌組織中T淋巴細(xì)胞顯著增加，且其細(xì)胞毒性大于非癌組織。胃癌病人周?chē)猅淋巴細(xì)胞毒性低于粘膜T淋巴細(xì)胞。但有人發(fā)現(xiàn)胃癌組織中T淋巴細(xì)胞的ADCC作用較弱。提示粘膜T淋巴細(xì)胞可能直接通過(guò)細(xì)胞毒作用或通過(guò)釋放淋巴因子對(duì)癌細(xì)胞有殺傷作用。近年來(lái)有人將癌組織中提取和分離出具有細(xì)胞毒作用T淋巴細(xì)胞，體外加入IL-2，促其增殖，再注入病人體內(nèi)進(jìn)行治療，取得明顯療效。
4．上皮細(xì)胞的MHC表達(dá)也與臨床疾病密切相關(guān)有人發(fā)現(xiàn)克隆病、潰瘍性結(jié)腸炎、放射性和感染性結(jié)腸炎和結(jié)節(jié) 病性腸炎患者小腸和結(jié)腸HLA-DR明顯增加，而且不成熟的腺體隱窩細(xì)胞也有表達(dá)。CD急性期和復(fù)發(fā)時(shí)HLA-DR表達(dá)明顯增加，緩解期明顯減少或恢復(fù)正常，說(shuō)明MHC的固有性和變易性所導(dǎo)致的免疫反應(yīng)的復(fù)雜性，在消化道疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要調(diào)節(jié) 作用。
