實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:第九節(jié)　其它鏈擴(kuò)增技術(shù)及應(yīng)用范圍

一、免疫PCRquanxiangyun.cn

所謂免疫（Immune PCR)就是利用抗體與DNA特異結(jié)合來(lái)檢測(cè)抗原，把抗原抗體反應(yīng)與PCR聯(lián)合應(yīng)用而建立的一種抗原檢測(cè)系統(tǒng)。

在免疫PCR中，一個(gè)中介分子同時(shí)具有與DNA、抗體分子特異結(jié)合的能力。其一端連接DNA（標(biāo)記物)，另一端連接抗原-抗體復(fù)合物，形成一個(gè)特殊的抗原-抗體-DNA連接物。作為標(biāo)記物的DNA分子可用PCR的擴(kuò)增，存在特異的PCR產(chǎn)物應(yīng)證明作為標(biāo)記物的DNA分子已特異地與抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合，而且表明了抗原的存在。有人采用SAP（streptavidin – protein A)嵌合體作為中介物。它具有雙特異性結(jié)合能力，一端為鏈霉親和素，可結(jié)合生物素；另一端為可與IgG的Fc段結(jié)合的蛋白A。這樣可特異地把生物素化的DNA分子和抗原-抗體復(fù)合物連接在一起。

選用BSA作抗原進(jìn)行免疫PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，可檢測(cè)出580個(gè)抗原分子（9.6×10^-22mol/L)，而且可以完全避免其它非特異信號(hào)的干擾。與采用堿性磷酸酶的ELISA相比，其靈敏度可提高10⁵倍，較常規(guī)的放名分析靈敏度也高出幾個(gè)數(shù)量級(jí)。

免疫PCR產(chǎn)物在普通的瓊脂糖電泳上就可以檢測(cè)出來(lái)，如用更好的方法來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物www.med126.com，如放射性同位素，熒光物或酶等摻入到PCR產(chǎn)物中，可進(jìn)一步提高其靈敏度和適用性。另外，如果采用不同大小標(biāo)準(zhǔn)的DNA進(jìn)行標(biāo)記，在電泳時(shí)，可同時(shí)檢測(cè)出多種不同的抗原分子。

PCR產(chǎn)物的多少與抗原結(jié)合量有關(guān)，如果用標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)作對(duì)照，則可以對(duì)抗原的量進(jìn)行估算。因此，通過(guò)改變連接物的濃度就可以改變檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏性。其它因素，如抗體的濃度，PCR循環(huán)周期數(shù)，PCR產(chǎn)物的檢測(cè)方法等也同樣影響系統(tǒng)的靈敏性。

二、轉(zhuǎn)錄依賴的擴(kuò)增系統(tǒng)（Transcription-basedAmplification System , TAS)

擴(kuò)增樣本中的RNA，一般要先將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能否將RNA靶序列直接擴(kuò)增出來(lái)呢？Kwok等人發(fā)明了TAS來(lái)解決這一問(wèn)題。結(jié)合應(yīng)用葡聚糖珠寡核苷酸雜交技術(shù)可進(jìn)一步提高方法的特異性和效率。其原理是：制備引物A、B，引物A與待檢RNA3’端互補(bǔ)，并有一T⁷RNA多聚酶的識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)。逆轉(zhuǎn)錄酶以A為起點(diǎn)合成cDNA；引物B與此cDNA3’端互補(bǔ)，逆轉(zhuǎn)錄酶同時(shí)還具有RnaseH和DNA多聚酶的活性，又可利用引物B合成cDNA的第二鏈。RNA多聚酶以此雙鏈cDNA為模板轉(zhuǎn)錄出與待檢RN-一樣的RNA，這些RNA又進(jìn)入下輪循環(huán)。RNA多聚酶從一個(gè)模板可以轉(zhuǎn)錄出10～10³個(gè)拷貝，因此反應(yīng)中待檢RNA拷貝數(shù)以10的指數(shù)方式增加，較PCR高得多。擴(kuò)增產(chǎn)物用葡聚糖珠夾心雜交法檢測(cè)：產(chǎn)物先與標(biāo)記的探針雜交，再與包被在葡聚糖珠上的另一互補(bǔ)寡核苷酸（與標(biāo)記探針互補(bǔ)的位置不同)雜交、檢測(cè)。該方法同一般雜交檢測(cè)技術(shù)相比，特異性要高出許多。

TAS主要特點(diǎn)是擴(kuò)增效率極高，由于拷貝數(shù)是以10指數(shù)遞增，只有6個(gè)循環(huán)，靶序列即能達(dá)到2×10⁶個(gè)拷貝。由此而來(lái)的另一個(gè)特點(diǎn)是特異性很高，在一般的RNa PCR擴(kuò)增中，由于逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq多聚酶均無(wú)較對(duì)活性，要發(fā)生錯(cuò)摻，循環(huán)次數(shù)越多，錯(cuò)摻率越高。TAS僅需循環(huán)4～6次，將錯(cuò)摻率降低了4/5。用葡聚糖珠夾心雜交法，又進(jìn)一步提高了特異性。目前認(rèn)為TAS是擴(kuò)增RNA的首選方法。

三、再生式序列復(fù)制技術(shù)（3SR)

這一反應(yīng)依賴于AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RnaseH和T⁷RNA多聚酶的共同作用。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈后，RnaseH降解模板RNA，逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第二鏈，T⁷RNA多聚酶以此cDNA為模板，轉(zhuǎn)錄出與樣本RNA序列相同的RNA。其RNA擴(kuò)增過(guò)程與TAS相同。由于所使用的工具酶工作的適宜溫度是37℃，所以只要在第一步變性、復(fù)性后，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程不再需要溫度循環(huán)。具體方法如下：制備引物A、B，引物A有T_７RNA多聚酶識(shí)別、結(jié)合位點(diǎn)。將引物、樣本加入擴(kuò)增緩沖液中，65℃，1min，降溫至37℃，加入人工具酶，37℃保溫1h，冰浴中止反應(yīng)。可用葡聚糖夾心法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

這一方法有幾點(diǎn)值得注意：（1)反應(yīng)是在37℃恒溫中進(jìn)行的；（2)產(chǎn)物中有RNA，反義RNA的cDNA，RNA的拷貝數(shù)高于Cdna（90：1)；（3)效率高于PCR。使拷貝數(shù)擴(kuò)增到10⁵，PCR要85min，3SR僅要15min；（4)逆轉(zhuǎn)錄酶也具有RnaseH活性，反應(yīng)又是在37℃中進(jìn)行，因此推測(cè)某些病毒，如HIV-1感染的細(xì)胞內(nèi)可能存在類似3SR的病毒基因擴(kuò)增機(jī)制。

四、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Ligase ChainReaction,LCR)

該技術(shù)是Landegren等人于1988年為檢出序列中點(diǎn)突變而設(shè)計(jì)、發(fā)明的。合成一對(duì)引物A、B，它們完成覆蓋了靶序列。經(jīng)退火與靶序列結(jié)合后，A、B間留下一個(gè)缺口（nick)，加入連接酶封閉缺品，兩引物成靶序列完整的互補(bǔ)鏈。如果靶序列中有點(diǎn)突變，引物不能與靶序列精確結(jié)合，缺口附近核苷酸的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，連接反應(yīng)不能進(jìn)行，變性后引物仍是兩個(gè)。Lan－degren用生物素標(biāo)記引物A，用³²P標(biāo)記引物B。用親和素包被的瓊脂糖珠與連接產(chǎn)物反應(yīng)，檢測(cè)其放射性。顯然，當(dāng)靶序列中存在點(diǎn)突變時(shí)，檢測(cè)結(jié)果是陰性的。用這種方式，Landegren將人β-珠蛋白βA、βC、βS三個(gè)等位基因區(qū)別開(kāi)來(lái)。Wu等人又引入PCR的原理，在連接反應(yīng)后，變性、退火、再連接，少量的靶序列就被擴(kuò)增出來(lái)。Barany于1991年報(bào)道了耐熱連接酶-Taq連接酶的發(fā)現(xiàn)及其在LCR中的應(yīng)用，為L(zhǎng)CR的實(shí)用化奠定了基礎(chǔ)。實(shí)際操作時(shí)引物為4個(gè)，A、A、　A’和B、B’，分別與靶序列的正負(fù)鏈互補(bǔ)。每次連接反應(yīng)的產(chǎn)物又可在下一輪反應(yīng)中當(dāng)模板，靶序列以指數(shù)形式擴(kuò)增出來(lái)。用上面提到的標(biāo)記檢測(cè)方法，即可檢測(cè)靶序列中有無(wú)點(diǎn)突變。

LCR的特異性首先取決于引物與模板的特異結(jié)合，其次Taq連接酶作用的特異性，即Taq連接酶是否僅連接與靶序列完全互補(bǔ)的引物。實(shí)驗(yàn)表明Taq連接酶的非特異活性是較低的（<1%)�？刂颇０濉⒚傅臐舛�，使反應(yīng)在接近Taq酶的溫度下進(jìn)行，還可進(jìn)一步降低非特異連接率。Barany用這一技術(shù)，將極少量（<200個(gè)分子)的βA、βC和βS區(qū)別開(kāi)來(lái)。

LCR的擴(kuò)增效率與PCR相當(dāng)。由于有很高的信噪比，其敏感性也很高。用Taq連接酶做LCR只在兩個(gè)保溫點(diǎn)的循環(huán)（94℃、1min和65℃、4min)。產(chǎn)物檢測(cè)也非常方便、敏感。因此可以說(shuō)LCR是目前檢測(cè)已知序列中有無(wú)點(diǎn)突變的最佳方法。

五、PCR-SSCP分析技術(shù)

近幾年來(lái)，在PCR基礎(chǔ)上完善和發(fā)展起來(lái)的多種基因變異檢測(cè)方法是基因分析和檢測(cè)的一次技術(shù)革命。其中日本學(xué)者創(chuàng)建的PCR-SSCP（Single-Strand ConformationPolymorphism anal－ysis of PCR products)格外重要。它是指單鏈DNA分子在變性PAGE中電泳遷移率隨其構(gòu)象的改變而改變的性質(zhì)。單鏈DNA分子的構(gòu)象改變即可由DNA多態(tài)性引起，又可由基因突變引起。為此，有的學(xué)者試圖用PCR-SSGE（Single-Strand Gel Electrophoresisof PCR products)代替原命名。

PCR-SSCP分析包括PCR擴(kuò)增和單鏈產(chǎn)物電泳兩個(gè)階段。對(duì)于分析小于400bp的PCR產(chǎn)物十分有效，對(duì)于大于400bp的PCR產(chǎn)物需處理后再分析，必須注意的是PCR-SSCP分析不能確定基因變異部位和內(nèi)容，泳動(dòng)后必須進(jìn)一步完成DNA測(cè)序。

六、結(jié)語(yǔ)

PCR技術(shù)以驚人的速度在研究與診斷領(lǐng)域得到應(yīng)用，限于篇幅所限，在此不一一進(jìn)行討論了。本章　重點(diǎn)討論了PCR技術(shù)發(fā)展的有關(guān)內(nèi)容，尤為影響PCR的主要因素和PCR的各種反應(yīng)模式及新進(jìn)展，以求大家在實(shí)際工作中能夠注意到這些問(wèn)題，并有所創(chuàng)新，相信由于PCR自身高敏感性及實(shí)用性，在分子生物學(xué)研究與醫(yī)學(xué)實(shí)踐中PCR技術(shù)將越來(lái)越受到人們的重視。無(wú)論從哪一個(gè)角度，PCR技術(shù)從分子水平對(duì)許多傳染病、遺傳性疾病和腫瘤進(jìn)行診斷，使法醫(yī)鑒定、生物進(jìn)化的研究更為簡(jiǎn)便和強(qiáng)化，在遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程與醫(yī)學(xué)研究中都占有重要的地位。

PCR技術(shù)是以生物體內(nèi)DNA復(fù)制為基礎(chǔ)理論的，這一技術(shù)把基礎(chǔ)理論與應(yīng)用有機(jī)結(jié)合起來(lái)，給我們以辯證的思考。對(duì)于其它學(xué)科中有關(guān)理論與實(shí)踐結(jié)合的問(wèn)題具有指導(dǎo)意義。PCR技術(shù)必將為我們提供大量有關(guān)核酸的知識(shí)，豐富我們的理論，改變我們以前的認(rèn)識(shí)，推動(dòng)學(xué)科的向前發(fā)展。