ApoB是富含膽固醇和甘油三酯脂蛋白的重要組成成分，對脂質(zhì)在人體轉運、代謝、維持體內(nèi)脂質(zhì)水平的恒定quanxiangyun.cn/zhicheng/起重要作用。大量臨床資料及流行病學調(diào)查表明：血清ApoB及低密度脂蛋白（LDL)水平與動脈粥樣硬化呈正相關，是其主要危險因素之一。近十年來，從分子水平研究ApoB，闡明動脈粥樣硬化及高脂血癥的發(fā)病機理，尋找其遺傳標志受到廣泛重視，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)：ApoB基因具有明顯的多態(tài)性，其核苷酸變異有75處，其中導致氨基酸變異的有54處，例如多種酶限制性片段長度多態(tài)性（RFLPs)，3’端高變區(qū)的數(shù)目可變的串聯(lián)重復順序（VNTR)，信號肽（SP)多態(tài)性。大量研究表明，ApoB的基因多態(tài)性與動脈粥樣硬化有不同程度的關系。
對ApoB基因多態(tài)性進行檢測、分析的方法很多，如：限制性內(nèi)切酶的酶譜分析法，PCR直接分析法，PCR產(chǎn)物RFLP分析法，等位基因特異性寡核苷酸（ASO)雜交法等等，其中最多用且簡單的方法有PCR產(chǎn)物直接分析法和PCR產(chǎn)物RFLP分析法。
PCR產(chǎn)物直接分析法，是采用合適的引物，通過多次擴增，獲得靶基因序列擴增片段，直接分析法片段的大小，可用于分析基因的缺失與插入。這種方法簡便、快速、靈敏，可分析ApoB基因VNTR、SP多態(tài)性。
基因突變往往會造成限制性內(nèi)切酶識別位點的改變，如位點丟失或產(chǎn)生新位點，通過PCR擴增某一特定片段，再用限制性內(nèi)切酶酶切擴增產(chǎn)物，電泳觀察片段的大小，這種方法用于檢測酶切位點改變的基因突變，可直接判斷基因型，是研究ApoB基因PFLPs的較好方法，具有靈敏、簡便、可同時對大量樣品進行分析等優(yōu)點。
ApoB基因多態(tài)性研究較多的有RFLP、VNTR、SP多態(tài)性，分別敘述如下：
1．RFLP的檢測
ApoB有10種RFLP，一般采用PCR-RPLPs方法進行分析，研究較多的有第26外顯子XbaⅠ、MspⅠ位點，第29外顯子EcoRⅠ位點，在Apob DNA上的位置如圖19-6，圖19-7所示：
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圖19-6 ApoB基因部分RFLPS示意圖
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圖19-6 ApoB基因多態(tài)性位置示意圖
用于PCR的引物如下：
XbaⅠ-5’GGAGACTATTCAGAAGCTAA
XbaⅠ-3’GAAGAGCCTGAAGACTGACT
EcoRⅠ-5’quanxiangyun.cn/jianyan/CTGAGAGAAGTGTCTTCGAAG
EcoRⅠ-3’CTCGAAAGGAAGTGTAATCAC
MspⅠ-5’TCTCGGGAATATTCAGGAACTATTG
MspⅠ-3’CTAAGGATCCTACAATGTCAAGGT
XbaⅠ酶切位點的RFLP是由于2488位密碼子第三個堿基突變（ACC→ACT)，產(chǎn)生一個XbaⅠ酶切位點，但并未改變所編碼的氨基酸序列，存在XbaⅠ酶切位點（X+)的等位基因，其PCR產(chǎn)物酶切后出現(xiàn)433bp和277bp兩個片段，不存在XbaⅠ酶切位點（X-)的等位基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后仍為其產(chǎn)物710bp片段。
RFLP是由于4154位密碼子改變（GAA→AAA)，使原有的EcoRⅠ酶切位點消失，氨基酸序列中賴氨酸取代谷氨酸，存在EcoRⅠ酶切位點（R+)的等位基因，其PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ酶切后得到253bp及227bp兩個片段，不存在EcoRⅠ酶切位點（R-)的等位基因，其PCR產(chǎn)物酶切后仍為480bp的片段。
MspⅠ酶切位點的RFLP，是由于3611位密碼子改變（CGG→CAG)，谷氨酰胺取代了精氨酸，含MspⅠ酶切位點（M+)的等位基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)MspⅠ酶切后可見到395bp和85bp的片段，不含MspⅠ酶切位點（M-)的等位基因，PCR產(chǎn)物酶切后仍為480bp。
眾多學者對ApoB基因RFLPs與動脈粥樣硬化之間的關系進行了研究。多數(shù)學者認為ApoE有XbaⅠ酶切位點（X+)，無EcoRⅠ酶切位點（E-)，無MspⅠ酶切位點（M-)的基因頻率，在動脈粥樣硬化性疾病的患者中比正常對照組高，但也有學者持不同甚至相反意見，究其原因，可能有以下幾點：①研究樣品例數(shù)不夠，有的少于100個甚至少于50個，可能使一些有意義的聯(lián)系被忽略；②對照組的選擇沒有統(tǒng)一的、嚴格的、明確的標準，有時與病員組缺乏可比性；③存在種族差異，例如XbaⅠRFLP基因頻率，X+等位基因在高加索人為0.4～0.5,日本人和中國人則僅為0.04、0.01；④某些遺傳標記之間可能存在連鎖關系，可導致結論互不相同。
2．VNTR的檢測
VNTR（數(shù)目可變的串聯(lián)重復順序)是繼RFLPs之后的又一類具有高度多態(tài)性的遺傳標記，廣泛分布于人類基因組中。ApoB基因3’端高變區(qū)（HVR)包含VNTR，由富含AT的DNA序列組成，其多態(tài)性特點是由10～15bp的核苷酸序列構成不同的等位基因，產(chǎn)生不同的重復序列拷貝數(shù)。以VNTR兩側特異性序列為引物，經(jīng)PCR擴增后直接電泳分析產(chǎn)物，片段之間的差異在于AT重復次數(shù)不同，重復37次稱為3β"37。依此類推，PCR引物可用以下序列：
VNTR-5’ATGGAAACGGAGAAATTATG
VNTR-3’CCTTCTCACTTGGCAAATAC
Boerwinkle等首先檢測出12種等位基因片段，現(xiàn)有學者已檢出22種不同等位基因。Frield等的研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生38、44、46或48個15bp長度重復序列的等位基因與冠心病、血漿膽固醇水平升高有關，且與EcoRi RFLP呈連鎖不平衡，與MspⅠRFLP呈連鎖平衡，Robinson等的研究則沒有發(fā)現(xiàn)ApoB的VNTR多態(tài)性與血漿膽固醇、甘油三酯、ApoB等水平有關。
3．信號肽（SP)多態(tài)性的檢測
ApoB基因5’信號肽（SP)由27個（插入型Ins)或24個（缺失型Del)氨基酸組成，可經(jīng)PCR擴增后直接分析，用于PCR的引物序列為：
IN/DE-5’CAGCTGGCGATGGACCCGCCGA
IN/DE-3’ACCGGCCCTGGCGCCCGCCAGCA
Wu等報告del/del基因型在高膽固醇血癥患者中比對照組中多見。Renges等對倫敦地區(qū)亞洲后裔的研究也發(fā)現(xiàn)帶del基因型者血漿總膽固醇升高，但與冠心病無明顯關系。Peacock等提出Ins/del多態(tài)性與冠心病的發(fā)展，即其嚴重程度有關，也有報道Ins/del多態(tài)性在冠心病與對照組中無明顯差別。
以ApoB基因第26個外顯子MspⅠ RFLP為例，具體介紹檢測的方法和步驟，筆者對湖北地區(qū)健康成人（120例)進行了檢測。
（一)材料
引物（如前所述)，TaqDNA聚合酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶MspⅠ、高速離心機、基因擴增儀、恒溫水浴箱、電泳系統(tǒng)、紫外監(jiān)測儀。
（二)方法
1.模板DNA的提取
可采用改良的TritonX-100法提取人白細胞DNA，此法結果穩(wěn)定，但操作較繁瑣，在此采用改進的Na裂解法提取人白細胞DNA，簡便、快速、靈敏、經(jīng)濟，步驟如下：
取EDTANa2抗凝血100μl，15000r/min離心5min，棄上層血漿，加無菌雙蒸水200μl，搖勻20s，加6mNaI200μl，搖勻20s，再加入氯仿/異戊醇（24/1)400μl，搖勻后15000r/min離心12min，小心吸取上層水相，移入另一離心管，加0.6倍體積的異丙醇，混勻后4℃放置15min，15000r/min離心12min，棄異丙醇，加入70%乙醇洗滌2～3次，室溫干燥，加入5μlTE緩沖液（pH=8.0)溶解DNA12～24h，4℃?zhèn)溆谩?/p>
2．模板DNA的擴增
采用聚合酶鏈反應（PCR)。反應總體積50μl，MgCl2終濃度為1.5mmol/L的1×Buffer,dNTp 0.2mmol/l，引物各20pmol,模板DNA約1.0μg，混勻，短暫離心，95℃預變性10min，加入Taq酶1.5U，液體石蠟50μl，短暫離心，按94℃ 45sec，60℃ 45sec,72℃1mim 15s循環(huán)30次，72℃延伸5min，置4℃貯存。
3．擴增產(chǎn)物的提純及酶切
取擴增產(chǎn)物20μl，加入醋酸銨至2.5mol/L,與無水乙醇混勻，4℃沉淀15min，12000r/min離心10min，棄上清，70%乙醇漂洗兩次，室溫干燥后加入含Mspi 10U的緩沖液37℃保溫2h，加入EDTA至10mmol/L終止反應。
4．擴增及酶切產(chǎn)物的檢測
（1)瓊脂糖電泳：制備2%瓊脂糖（含0.5μg/ml EB)，將擴增產(chǎn)物與標準DNA（PGEM3zf（+)/HaeⅢ)點樣，電壓4v/cm，電泳，紫外燈下觀察。
（2)聚丙烯酰胺凝膠電泳：將擴增及酶切產(chǎn)物加樣于8%聚丙烯酰胺凝膠上，電壓6V/cm，電泳4h，EB染色，紫外燈下觀察。
（3)結果：擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳，紫外燈下呈一條強熒光帶，與已知DNa Marker相比較，約位于480bp的位置，與設計相符。
擴增產(chǎn)物經(jīng)MspⅠ酶切后，在8%PAGE上，可見到三種類型：①原始帶消失，出現(xiàn)兩條新帶，長度為395bp和85bp，為含酶切位點的M+M+純合子；②酶切后除與擴增產(chǎn)物相同位置的原始帶外，還有兩條長度為395bp和85bp的帶，共三條帶，為M+M-雜合子；③酶切后僅有一條帶，與擴增產(chǎn)物位置相同，為無酶切位點的M-M-純合子。
以上三種基因型，以含酶切位點的純合型（M+M+)最多見，120例中有114例，不含酶切位點的M-M-型最少見，僅有1例，雜合型（M+M-)有5例，根據(jù)基因頻率計算方法，等位基因M+頻率為0.97，少見等位基因M-頻率為0.03。
若對冠心病患者同時進行檢測，計算基因頻率，可見到：少見等位基因M-在冠心病組比健康對照組高，有顯著性差異，但無論在冠心病組還是健康對照組，各基因型個體間的血脂、脂蛋白、載脂蛋白水平均無顯著性差異，這說明Apob MspⅠ多態(tài)性與冠心病有關，但與血中脂類水平的關系不明顯，這可能是由于環(huán)境因素，激素及其他遺傳因素對脂質(zhì)水平的影響較明顯，掩蓋了Apob MspⅠRFLP對脂質(zhì)的影響，也可能是這種多態(tài)性與ApoB基因上其他位點的多態(tài)性有連鎖關系。另外，由于少見等位基因M-的頻率很低，有必要加大樣本例數(shù)，進行進一步的研究。
