動脈粥樣硬化:第四節(jié)　載脂蛋白E

一、ApoE的蛋白結構

載脂蛋白E是一種富含精氨酸的堿性蛋白，人ApoE299個氨基酸殘基組成，分子量為34145D，含32個Arg和12個Lys存在于血漿的CM、VLDL及其殘粒和β-VLDL中均含有ApoE，一部分ApoE在血液中與ApoAⅡ形成復合體。

Shore于1973年首先發(fā)現(xiàn)ApoE，Rall等于1982年測出ApoE的蛋白質一級結構，其后Taylor建立ApoE的cDNA序列，Breslow 和Zannis首先測出ApoE有3個等位基因異構體以及基因在染色體上的定位。據(jù)推算和測定，在介質中ApoE有62%的α-螺旋，9%的β-片層，11%的β-轉角和18%無規(guī)則線團。ApoE分子可以被凝血酶水解為二個區(qū)域，N-端區(qū)（1～191)為22kD的可溶性球蛋白，此區(qū)域較穩(wěn)定，該片段的136～158位肽段為受體結合位點，富含堿性氨基酸（賴氨酸和精氨酸)，也屬于肝素結合區(qū)。此片段為一個反平行的四螺旋束，是α-螺旋蛋白的一般折疊方式。C端區(qū)（216～299)分子量為10kD，螺旋程度很高，不穩(wěn)定，是與脂蛋白的結合區(qū)。用截去了末端的變異體及合成多肽片段進行ApoE羧基末端的檢測表明，191殘基以外羧基端存在三個螺旋，其中兩個為A型（203～223和225～266)，第三個（268～289)為一種G型螺旋。與脂類或不同的脂質微粒或二甲基磷脂酰膽堿結合的結果說明，G螺旋和第二螺旋的末端在脂質連結，在ApoE的四聚體化過程中起重要的作用。更精確地說是263～286片段可能在脂連結ApoE與VLDL的結合中起有關鍵作用。ApoE主要由肝臟合成，近年來發(fā)現(xiàn)腦，腎，骨骼，腎上腺及巨噬細胞也能合成。ApoE其結構如圖3-2所示。

圖3-2 載脂蛋白E結構示意圖

二、ApoE的生理功能

ApoE生理功能有：①是LDL受體的配體，也是肝細胞CM殘粒受體的配體，它與脂蛋白代謝有密切相關性；②ApoE具有多態(tài)性，多態(tài)性是決定個體血脂水平與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展密切相關；③參與激活水解脂肪的酶類，參與免疫調節(jié)及神經(jīng)組織的再生。

人類ApoE主要在肝臟和腦組織合成，在其他組織包括單核細胞（含巨噬細胞)也有合成能力。人的腎上腺、卵巢顆粒細胞也能合成ApoE。腦中ApoE的mRNA表達總量是肝臟的1/3，星形細胞是其主要合成部位。腦中生成的ApoE的作用可能是使細胞內的脂類重新分配而保持腦環(huán)境中的膽固醇平衡。腦腫瘤中發(fā)現(xiàn)有高濃度的ApoE，推斷它可能作為神經(jīng)膠質細胞瘤的標記。

三、ApoE多態(tài)性

Utermann等于1975年首先觀察到ApoE多態(tài)性，利用等電聚焦電泳和SDS-PAGE可以確認ApoE的多態(tài)性，其后又被直接檢測的cDNA序列所證實。ApoE有三種構體（isoform)即E₂、E₃和E₄。有的人只含有一種主要異構體，即為純合子；www.med126.com有人可含兩種主要異構體，即為雜合子。由此可見，人群中可有六種不同的表型（phenotype)。

各種生物都能通過生殖產生子代，子代和親代之間，無論在形態(tài)構造或生理機能的特點上都很相似，這種現(xiàn)象稱為遺傳（heredity)，但是，親代和子代之間，子代的各個體之間不會完全相同，總會有所差異，這種現(xiàn)象叫變異（variation)。遺傳和變異是生命的特征。遺傳和變異的現(xiàn)象是多樣而復雜的，正因為如此，才導致生物界的多種多樣性，生物體所具有的遺傳性狀稱為表型或表現(xiàn)型（phenotype)，生物所具有的特異基因成分稱為基因型（genotype)。表型是基因型與環(huán)境因素相互作用的結果。遺傳物質是相對穩(wěn)定的，但又是可變的，遺傳物質的變化以及由其所引起表型的改變，稱為突變（mutation)。遺傳物質的突變包括染色體畸變和基因突變。基因突變是染色體中某一點上發(fā)生化學改變，所以又稱為點突變（point mutation)�；�因結構和遺傳表型的研究是深入了解脂蛋白代謝缺陷癥的分子生物學基礎，逆向遺傳學方法（reversegenetic approach)則使其有可能在蛋白質水平系統(tǒng)地分析結構和功能的關系�，F(xiàn)已采用一個特定的cDNA探針從基因庫中篩選所需要的基因進行cDNA克隆，測定其核苷酸序列，然后從核苷酸序列推斷蛋白質氨基酸序列。目前已分離出許多與動脈粥樣硬化有關的脂蛋白的cDNA克隆，并將其蛋白質一級結構的氨基酸排列順序和基因的核苷酸順序測出�，F(xiàn)已查明，ApoAⅠ,ApoⅣ,ApoE, ApoB, ApoCⅡ和Apo（a)都存在著異構體，也就是說存在著各種不同的表型或基因型，并可分別從蛋白質水平和核酸水平進行分型。

Zannis于1981年根據(jù)ApoE表型提出ApoE基因模型，認為ApoE的合成是由位于一個基因位點上的三個等位基因所控制，即E₂、E₃和E₄，每一個等位基因對應于一個主要異構體產生三種純合子（E2/2，E3/3，E4/4)和三種雜合子（E2/3，E2/4，E3/4)共六種常見表型，另外還有極少見的異構體。一般認為，次要異構體是由主要異構體翻譯后，經(jīng)唾液酸糖化修飾后轉變而來。ApoE3/3型又稱野生型。ApoE的氨基酸序列的112位和158位兩種氨基酸殘基即精氨酸（Arg)和半胱氨酸（Cys)的交換決定了異構體的種類。ApoE4在這兩個位置上都是Arg；E₂都是Cys；112位為Cys和158位是Arg者為ApoE3異構體，見圖3-3所示，自然人群中，基因頻率ε3分布最高，ApoE3/3表型分布約70%。

圖3-3 人ApoE三種主要異構體的氨基酸殘基及基因密碼的改變位置

由于ApoE多態(tài)性具有生物學重要性，對ApoE多態(tài)性的研究是目前醫(yī)學的熱門話題。ApoE表型和基因型的檢測方法很多，多年來先后采用等電聚焦電泳和基因分析術進行檢測。目前從基因水平研究ApoE基因型顯然優(yōu)于其蛋白表型，因為ApoE翻譯后修飾會影響蛋白分析，常見ApoE的蛋白表型和基因型圖譜如圖3-4、圖3-5所示。

圖3－4　等電聚焦檢測的ApoE表型

圖3-5 ApoE基因PCR產物HhaⅠ酶切后RFLP圖譜

M：PBr 322 DNA/Hhe Ⅲ Markers;1-5；分別為ε4/4、ε4/2、ε4/3和3/3；基因型6：PCR產物（292bp)

四、ApoE多態(tài)性與疾病

人群中ApoE多態(tài)性存在種族變異，不同人群中ApoE基因型高度不同。歐洲人ε4等位基因頻率從北到南呈下降趨勢的分布。亞洲人ε4頻率低，相比之下，非洲人及巴布比亞和新幾內亞ε4頻率高。

由于早期觀察到ApoE2/2表型的Ⅲ型高脂蛋白血癥病人未在成年即患冠心病，從此，對ApoE多態(tài)性進行了廣泛研究，許多證據(jù)認為，ApoE多態(tài)性是動脈粥樣硬化早期及發(fā)展過程中個體差異的主要原因。大量人群調查發(fā)現(xiàn)ε4等位基因的一般作用是可以顯著地升高健康人的總膽固醇濃度，使之易患動脈粥樣硬化，相反，ε2等位基因的一般作用是降低膽固醇濃度，其降低效應是ε4升高膽固醇的2～3倍。ApoE等位基因變異還與血漿ApoB濃度、甘油三酯及血管收縮壓有關。Menzel等認為ε2等位基因對冠狀動脈硬化的發(fā)展有防護作用，經(jīng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，患心血管疾病如心肌梗塞幸存者，或血管造影證明有動脈粥樣硬化者，比其對照組的ε4等位基因頻率高。ApoE4/3雜合子比E3/2和E3/3基因型者發(fā)生心肌梗塞年齡早。ApoE多態(tài)性變異還與腎病綜合癥、糖尿病有關。

值得重視的是ApoE多態(tài)性與老年性癡呆病（AD)的關系。1993年，Rose研究發(fā)現(xiàn)，晚發(fā)性家族型AD病人ε4頻率增多，還發(fā)現(xiàn)ApoE和來源于淀粉樣前體蛋白的小多肽Aβ的親和力很高。其后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)AD病人中攜帶ε4等位基因者占46.2%，而對照組占13.2%。還發(fā)現(xiàn)攜帶二個ε4等位基因的研究對象比攜帶一個ε4的研究對象發(fā)生AD年齡早，比不攜帶ε4等位基因的研究對象發(fā)生AD年齡更早，1994年，Schacher等人相繼報道百歲老人普遍攜帶ε2基因。。這一發(fā)現(xiàn)使ApoE多態(tài)性和研究向前邁出了一大步。有報道高老年人攜帶ε2等位基因數(shù)量是年青人的2倍。因此ε2等位基因似乎不僅可以保護人們免患AD，而且還與長壽有關。ApoE多態(tài)性與AD的關系，目前的研究主要集中在腦代謝中與Aβ或Tau蛋白以及神經(jīng)元生長和分枝等有關。

總之，在研究高脂血癥評定心腦血管疾病的危險因素方面，以ApoE多態(tài)性為手段進行研究有重要的臨床意義。有學者認為，基因型的“壞”（ε4)和“好”（ε2)的等位基因之間的平衡，可作為基因分析應用于醫(yī)學檢驗領域，協(xié)助臨床疾病的診斷。