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動脈粥樣硬化:第四節(jié) 載脂蛋白CⅢ基因型檢測

載脂蛋白CⅢ基因位于11號染色體與載脂蛋白AⅠ-AⅣ形成一基因族,它位于載脂蛋白AⅠ下游,有三個內含子和四個外顯子。目前對載脂蛋白CⅢ基因3末端非編碼區(qū)C-G對換產(chǎn)生一個Sac-Ⅰ酶切位點與冠心病的關系未有定論。用多聚酶鏈反應(PCR)擴增載脂蛋白CⅢ基因3末端233bp,再…

載脂蛋白CⅢ基因位于11號染色體與載脂蛋白AⅠ-AⅣ形成一基因族,它位于載脂蛋白AⅠ下游,有三個內含子和四個外顯子。目前對載脂蛋白CⅢ基因3"末端非編碼區(qū)C-G對換產(chǎn)生一個Sac-Ⅰ酶切位點與冠心病的關系未有定論。用多聚酶鏈反應(PCR)擴增載脂蛋白CⅢ基因3"末端233bp,再用Sac-1酶切擴增產(chǎn)物,可以檢測載脂蛋白CⅢ基因3"末端的突變及其與動脈粥樣硬化相關性。本節(jié)采用PCR-RFLP檢測ApoCⅢ基因型。

一、儀器與試劑

1.儀器:電泳儀,基因擴增儀。

2.試劑:TaqDNA聚合酶,dNTP,DNA參考物,Sca-1酶。

二、操作方法

1.模DNA提取

取用EDTA抗凝全血100μl加試劑(0.32mol/L蔗糖,5mmol/l MgCl2,1%TritonX-100,0.01mol/L Tris-HClpH7.6),振搖至溶解均勻透明,3000r/min離心10min,棄上清,沉淀部分加0.9NaCl溶液洗一次,加預冷試劑Ⅱ(75mmol/l NaCl,24mmol/L EDTA)100μl,20%SDS15μl,蛋白酶K10μl(6g/L)于65℃水浴4h,加200μl酚和氯仿:異戊醇(24:1)各提兩次,上清加無水乙醇1.0ml放置于-20℃2h,以12kr/min離心5min,真空干燥后加50μlTE緩沖液溶解,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.多聚酶鏈反應

Primer1:5"-GTGACC GAT GGC TTC AGT TCC CTG-3",primer2:5"-GGt AGG AGAGCA CTC AGA ATA CA-3"。反應總體積為50μl,擴增緩沖液所含物質終濃度為:Tris-HCl,pH8.3,67mmol/L;MgCl225mmol/L;KCl 50mmol/L;明膠0.01%,dNTP各0.2~0.5μmol/L,模板約10μg,加40μl液體石蠟,94℃預變性4min,加Tag聚合酶1.5U,以93℃1min、65℃1.5min、72℃1.5min,循環(huán)30次。

3.擴增產(chǎn)物酶切

取擴增產(chǎn)物20μl加入NH4AC20μl,再加300μl無水乙quanxiangyun.cn醇混均置-20℃1h,10000r/min離心7min棄上清,干燥后加Sac-1酶液10μl37℃保溫2h。

4.擴增產(chǎn)物堿基對分quanxiangyun.cn/zhicheng/子量測定

采用GB公司產(chǎn)DNamarker,以已知DNA片段bp數(shù)相對應的電泳遷移距離,取半對數(shù)作圖制成標準曲線,再根據(jù)等測定擴增產(chǎn)物DNA片段移動距離在標準曲線上求出其bp數(shù)。

三、結果分析

采用本節(jié)設計引物擴增產(chǎn)物為ApoCⅢ基因3"非編碼區(qū)233bp,該產(chǎn)物經(jīng)Sac-1酶切可出現(xiàn)三種結果;①酶切后仍為一條帶,電泳遷移率未發(fā)生改變,為S1S1純合子;②酶切后除原始帶外又增加了兩條帶,查標準DNa marker曲線在158bp和75bp相同,為S2S2雜合子;③酶切后原始帶消失,出現(xiàn)兩條新帶,其電泳遷移率與158bp和75bp相同,為S2S2純合子。S2為擴增的基因產(chǎn)物中C-G對換增加一個酶切位點。

檢查100名正常人中有S2雜合子28名,純合子2名;68名冠心病人中S2雜合16名,純合子4名,它們的頻率變化見表(19-4)。S2基因頻率兩組間無明顯差別。

表19-4 載脂蛋白CⅢ基因Sac-Ⅰ酶切頻率表

級別n基因型頻 率
S1S1S1S2S2S2S1S2 
正常人100702820.840.16
冠心病68481640.820.176

X=0.079,p>0.05(兩組比較)

(徐瓊)

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