原位雜交技術(shù)在染色體鋪片的應(yīng)用

　　四、利用性染色體特異性DNA探針的ISHH技術(shù)

　�。ㄒ�)基本原理

　　利用性染色體X或Y的特異性DNA探針的ISHH技術(shù)進行胎兒生前（Prenatal)性別的診斷，樣品取自于羊水、絨毛或胎兒的血液。近年，科技工作者又成功地進行了胚前（pre-embry－o)或植入前（preimplantation)的ISHH診斷。所謂胚前診斷是在受精卵植入子宮內(nèi)膜前的4～6細胞期，以顯微操縱器（micromanipulator)或微型吸管穿破透明帶，將分裂球或其中的部分細胞吸出放入培養(yǎng)液內(nèi)，應(yīng)用ISHH技術(shù)進行性染色體的分析，如有染色體畸形，可及早移除，避免以后進行人工流產(chǎn)術(shù)。本技術(shù)可還用于鑒別精子是帶X或Y染色體。如果1個婦女遺傳性基因是與X染色體相聯(lián)系的，那么可給予人工授精只帶X染色體的精子以避免其子代有遺傳疾病的危險。當(dāng)然帶X染色體的精子的分離技術(shù)還有待于研究和建立。目前這還是一種實驗性設(shè)想。羊水可在16～20周妊娠期吸取。在18～19周時，20ml的羊水內(nèi)大約含100萬個細胞，含大約7μgDNA。絨毛膜的絨毛可在3～6月取，每次可獲5～50mg的組織。應(yīng)注意在應(yīng)用前清除母體細胞。胎血0.2～0.7ml可在17～40周采取，在15～21周，胎血中含2×10⁹白細胞/L和類似數(shù)量的有核紅細胞（Miller et al, 1985)。在32～34周，有核紅細胞的比例數(shù)降至0～50/每100個白細胞。這種以性染色體為探針的ISHH技術(shù)，可應(yīng)用于分裂中期的染色體鋪片上，也可以應(yīng)用于間期細胞核制片。性染色體ISHH技術(shù)在下列場合特別有用，如（1)當(dāng)無足夠的分裂細胞供可靠的細胞遺傳學(xué)分析時；（2)當(dāng)胎兒面臨性染色體連鎖遺傳性疾病的危險而需做迅速的性別確定時；（3)協(xié)助鑒別45，X/46，XY鑲嵌和其它異常染色體的鑲嵌類型；（4)當(dāng)一雌性具有一Y染色體的雜交時，應(yīng)檢查其父母的血樣品，因為在正常情況下有部分的雄性具有2個Y染色體。這里只敘述了性染色體在ISHH技術(shù)的應(yīng)用，如用同樣技術(shù)標(biāo)記其它染色體也可能對其它遺傳性疾病進行診斷，如Julien等（1986)曾應(yīng)用染色體21號DNA探針于間期細胞核，出現(xiàn)3倍體，為常見遺傳性疾病Down氏綜合征的診斷特征（發(fā)病率為1/700出生者)，同樣，在Edward氏綜合癥（遺傳性疾病出現(xiàn)率1/3000出生者)顯示18號染色體為3倍體。West實驗室進行了大量的性染色體的ISHH實驗，并比較了各種標(biāo)記物的優(yōu)缺點，他經(jīng)反復(fù)實驗后承認非放射性同位素標(biāo)記物如生物素、地高辛具有許多優(yōu)點，但在性染色體的ISHH顯示，他認為至少在他的實驗室同位素³H的標(biāo)記優(yōu)于其它的標(biāo)記物。

　�。ǘ�)基本操作方法

　　1．Y染色體³H標(biāo)記DNA探針原位雜交技術(shù)

　�。�1)探針標(biāo)記，以³H標(biāo)記Y染色體DNA探針（詳見第19章　)。

　　（2)原位雜交

　�、賀NA酶的前處理：取1ml RNA酶保存液（10mg/ml)于250ml 2×SSC內(nèi)，預(yù)熱于37℃水浴中。選具有適量的細胞分布的載片孵育于稀釋的RNA酶溶液中，37℃，1h。系列等級乙醇脫水，70%，90%，100%乙醇各2min，空氣干燥。

　�、谙喈�(dāng)250ml的預(yù)雜交液（含70%甲酰胺，0.6×SSC配)，70℃水浴。置載片于此預(yù)雜交液內(nèi)2min以使靶DNA變性，如（1)經(jīng)系列等級乙醇脫水，空氣干燥。

　�、跠NA探針準(zhǔn)備與變性

　　雜交液：10×SSC　　　　20%

　　tRNA 　　　　　　　　　10%

　　甲酰胺 　　　　　　　　50%

　　硫酸葡聚糖 　　　　　　20%

　　DNA探針-³H　　　　　　 20%

　　均勻混合，70℃水浴5min使探針變性，然后迅速置冰上冷卻。

　　10×SSC：1.2mmol/L NaCl

　　0.15mmol/L醋酸鈉

　　0．2_{mol/L NaPO4}

　　tRNA(Sigma R1759)4mg/ml(用TE緩沖液配)，-4℃保存。

　　TE緩沖液：10mmol/L Tris,1mmol/L EDTA,Ph7.5。

　　每張載片加20μl含探針的雜交液，覆以蓋玻片，四周用橡皮泥封固，于37℃孵育過夜�？蓽y定³H的放射比性，以了解每張載片的探針含量。

　　④雜交后漂洗，次日移除蓋玻片，用緩沖液39℃漂洗

　　50%甲酰胺1×SSC 　　　　4×5min

　　1×SSC　　　 39℃　　　 4×5min

　　⑤系列等級乙醇脫水，70%，90%，100%各2min，空氣干燥。

　�。�3)放射自顯影（詳見二十章　第一節(jié)　)：浸入核乳膠，暗盒于冷室或4℃冰箱儲存，顯影，定影，復(fù)染，封固和觀察。應(yīng)用³H標(biāo)記pHY2.1DNA探針，其曝光時間大約為6～7日。

　　2．雜交前精子的處理

　�。�1)取1ml用緩沖液清洗過的精子，加1ml 6mmol/L EDIT(60μl 0.2mol/L EDTA加1940μl的BWW培養(yǎng)基)。留置于室溫5～10min，離心（1000rpm(175×g)5min。

　�。�2)棄上清液，沉淀的精子內(nèi)加1ml 2mmol/L DTT(dithiothretiol, DTT,二硫蘇糖醇)，配法：154μl的DTT加1846μl(4g/ml)BWW培養(yǎng)基（Gibbers et al, 1971)，置室溫45min,再離心1000rpm 5min。

　�。�3)棄上清液，用BWW培養(yǎng)基再稀釋、離心。

　�。�4)加新鮮配制固定劑（甲醇：醋本以=3：1)，反復(fù)混勻或置于漩渦式的混勻器上混勻，室溫30～60min，離心。

　　（5)加數(shù)滴新鮮固定劑于離心管中，如上再混勻。迅速從混勻液中取2～3滴精液滴于載玻片上，空氣干燥，以相差顯微鏡檢查確有精子存在，保存在清潔的干盒中備用。

　�。�6)在ISHH以前，取出載片，加數(shù)滴0.05% SDS(20μl 0.05% SDS/每2ml BWW培養(yǎng)基)，靜置5min，傾去SDS（十二烷基磺酸鈉，配制法見附錄2)，以2×SSC漂洗，系列等級乙醇脫水，70%，90%，100%各2min，空氣干燥。

　�。�7)雜交步驟同上，雜交后以0.5%伊紅黃（Eosin yellow)復(fù)染，自來水沖洗，空氣干燥，DPX封固。

　　本節(jié)　簡要介紹了ISHH技術(shù)在染色體鋪片應(yīng)用的三個方面，并摘要介紹了它們的應(yīng)用及操作方法。由于這一技術(shù)在國際上也處于剛起步階段，其發(fā)展主要在近10年，國內(nèi)尚未開展，因此，此一技術(shù)的應(yīng)用還有待于不斷的摸索與完善。必須說明的是ISHH在染色體制片的應(yīng)用也需設(shè)置對照實驗組（詳見第二十章　第一節(jié))。

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