四、利用性染色體特異性DNA探針的ISHH技術(shù)
。ㄒ)基本原理
利用性染色體X或Y的特異性DNA探針的ISHH技術(shù)進行胎兒生前(Prenatal)性別的診斷,樣品取自于羊水、絨毛或胎兒的血液。近年,科技工作者又成功地進行了胚前(pre-embry-o)或植入前(preimplantation)的ISHH診斷。所謂胚前診斷是在受精卵植入子宮內(nèi)膜前的4~6細胞期,以顯微操縱器(micromanipulator)或微型吸管穿破透明帶,將分裂球或其中的部分細胞吸出放入培養(yǎng)液內(nèi),應(yīng)用ISHH技術(shù)進行性染色體的分析,如有染色體畸形,可及早移除,避免以后進行人工流產(chǎn)術(shù)。本技術(shù)可還用于鑒別精子是帶X或Y染色體。如果1個婦女遺傳性基因是與X染色體相聯(lián)系的,那么可給予人工授精只帶X染色體的精子以避免其子代有遺傳疾病的危險。當(dāng)然帶X染色體的精子的分離技術(shù)還有待于研究和建立。目前這還是一種實驗性設(shè)想。羊水可在16~20周妊娠期吸取。在18~19周時,20ml的羊水內(nèi)大約含100萬個細胞,含大約7μgDNA。絨毛膜的絨毛可在3~6月取,每次可獲5~50mg的組織。應(yīng)注意在應(yīng)用前清除母體細胞。胎血0.2~0.7ml可在17~40周采取,在15~21周,胎血中含2×109白細胞/L和類似數(shù)量的有核紅細胞(Miller et al, 1985)。在32~34周,有核紅細胞的比例數(shù)降至0~50/每100個白細胞。這種以性染色體為探針的ISHH技術(shù),可應(yīng)用于分裂中期的染色體鋪片上,也可以應(yīng)用于間期細胞核制片。性染色體ISHH技術(shù)在下列場合特別有用,如(1)當(dāng)無足夠的分裂細胞供可靠的細胞遺傳學(xué)分析時;(2)當(dāng)胎兒面臨性染色體連鎖遺傳性疾病的危險而需做迅速的性別確定時;(3)協(xié)助鑒別45,X/46,XY鑲嵌和其它異常染色體的鑲嵌類型;(4)當(dāng)一雌性具有一Y染色體的雜交時,應(yīng)檢查其父母的血樣品,因為在正常情況下有部分的雄性具有2個Y染色體。這里只敘述了性染色體在ISHH技術(shù)的應(yīng)用,如用同樣技術(shù)標(biāo)記其它染色體也可能對其它遺傳性疾病進行診斷,如Julien等(1986)曾應(yīng)用染色體21號DNA探針于間期細胞核,出現(xiàn)3倍體,為常見遺傳性疾病Down氏綜合征的診斷特征(發(fā)病率為1/700出生者),同樣,在Edward氏綜合癥(遺傳性疾病出現(xiàn)率1/3000出生者)顯示18號染色體為3倍體。West實驗室進行了大量的性染色體的ISHH實驗,并比較了各種標(biāo)記物的優(yōu)缺點,他經(jīng)反復(fù)實驗后承認非放射性同位素標(biāo)記物如生物素、地高辛具有許多優(yōu)點,但在性染色體的ISHH顯示,他認為至少在他的實驗室同位素3H的標(biāo)記優(yōu)于其它的標(biāo)記物。
。ǘ)基本操作方法
1.Y染色體3H標(biāo)記DNA探針原位雜交技術(shù)
。1)探針標(biāo)記,以3H標(biāo)記Y染色體DNA探針(詳見第19章 )。
(2)原位雜交
、賀NA酶的前處理:取1ml RNA酶保存液(10mg/ml)于250ml 2×SSC內(nèi),預(yù)熱于37℃水浴中。選具有適量的細胞分布的載片孵育于稀釋的RNA酶溶液中,37℃,1h。系列等級乙醇脫水,70%,90%,100%乙醇各2min,空氣干燥。
、谙喈(dāng)250ml的預(yù)雜交液(含70%甲酰胺,0.6×SSC配),70℃水浴。置載片于此預(yù)雜交液內(nèi)2min以使靶DNA變性,如(1)經(jīng)系列等級乙醇脫水,空氣干燥。
、跠NA探針準(zhǔn)備與變性
雜交液:10×SSC 20%
tRNA 10%
甲酰胺 50%
硫酸葡聚糖 20%
DNA探針-3H 20%
均勻混合,70℃水浴5min使探針變性,然后迅速置冰上冷卻。
10×SSC:1.2mmol/L NaCl
0.15mmol/L醋酸鈉
0.2mol/L NaPO4
tRNA(Sigma R1759)4mg/ml(用TE緩沖液配),-4℃保存。
TE緩沖液:10mmol/L Tris,1mmol/L EDTA,Ph7.5。
每張載片加20μl含探針的雜交液,覆以蓋玻片,四周用橡皮泥封固,于37℃孵育過夜?蓽y定3H的放射比性,以了解每張載片的探針含量。
④雜交后漂洗,次日移除蓋玻片,用緩沖液39℃漂洗
50%甲酰胺1×SSC 4×5min
1×SSC 39℃ 4×5min
⑤系列等級乙醇脫水,70%,90%,100%各2min,空氣干燥。
。3)放射自顯影(詳見二十章 第一節(jié) ):浸入核乳膠,暗盒于冷室或4℃冰箱儲存,顯影,定影,復(fù)染,封固和觀察。應(yīng)用3H標(biāo)記pHY2.1DNA探針,其曝光時間大約為6~7日。
2.雜交前精子的處理
。1)取1ml用緩沖液清洗過的精子,加1ml 6mmol/L EDIT(60μl 0.2mol/L EDTA加1940μl的BWW培養(yǎng)基)。留置于室溫5~10min,離心(1000rpm(175×g)5min。
。2)棄上清液,沉淀的精子內(nèi)加1ml 2mmol/L DTT(dithiothretiol, DTT,二硫蘇糖醇),配法:154μl的DTT加1846μl(4g/ml)BWW培養(yǎng)基(Gibbers et al, 1971),置室溫45min,再離心1000rpm 5min。
。3)棄上清液,用BWW培養(yǎng)基再稀釋、離心。
。4)加新鮮配制固定劑(甲醇:醋本以=3:1),反復(fù)混勻或置于漩渦式的混勻器上混勻,室溫30~60min,離心。
(5)加數(shù)滴新鮮固定劑于離心管中,如上再混勻。迅速從混勻液中取2~3滴精液滴于載玻片上,空氣干燥,以相差顯微鏡檢查確有精子存在,保存在清潔的干盒中備用。
。6)在ISHH以前,取出載片,加數(shù)滴0.05% SDS(20μl 0.05% SDS/每2ml BWW培養(yǎng)基),靜置5min,傾去SDS(十二烷基磺酸鈉,配制法見附錄2),以2×SSC漂洗,系列等級乙醇脫水,70%,90%,100%各2min,空氣干燥。
。7)雜交步驟同上,雜交后以0.5%伊紅黃(Eosin yellow)復(fù)染,自來水沖洗,空氣干燥,DPX封固。
本節(jié) 簡要介紹了ISHH技術(shù)在染色體鋪片應(yīng)用的三個方面,并摘要介紹了它們的應(yīng)用及操作方法。由于這一技術(shù)在國際上也處于剛起步階段,其發(fā)展主要在近10年,國內(nèi)尚未開展,因此,此一技術(shù)的應(yīng)用還有待于不斷的摸索與完善。必須說明的是ISHH在染色體制片的應(yīng)用也需設(shè)置對照實驗組(詳見第二十章 第一節(jié))。