三、利用ISHH技術(shù)對(duì)腫瘤或癌前組織的細(xì)胞間期染色體鋪片進(jìn)行研究
�。ㄒ�)基本原理
在惡性的或癌前病變的組織，染色體組含量與結(jié)構(gòu)的畸變?cè)诓糠植±信c疾病的預(yù)后相一致。由于染色體基因的變化可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展，利用一些技術(shù)預(yù)測(cè)這些遺傳物質(zhì)的變化可為惡性腫瘤的檢測(cè)及了解其進(jìn)展和預(yù)后提供資料。流式細(xì)胞計(jì)（FCM)和染色體組型，即核型分析（karyothping analyses)等技術(shù)曾被用于這個(gè)領(lǐng)域的研究。FCM可測(cè)定腫瘤細(xì)胞DNA的含量，但它不能顯示特異性染色體的結(jié)構(gòu)異常，而且對(duì)微量的DNA含量改變難以檢測(cè)。核型分析可以顯示染色體結(jié)構(gòu)和含量的變化，但要分析腫瘤細(xì)胞的核型只有在細(xì)胞培養(yǎng)以后。細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞的高度分裂指數(shù)和細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致染色體物質(zhì)的丟失，而且核型分析不能顯示特異性DNA探針的原位雜交技術(shù)，能夠檢測(cè)在細(xì)胞分裂間期細(xì)胞核內(nèi)染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)的異常變化。因此，這項(xiàng)技術(shù)又被稱為“間期細(xì)胞遺傳學(xué)分析法（Interphase Cytogenetics Analysis, ICA)。間期細(xì)胞遺傳學(xué)的基本原理是利用合成的特異性DNA探針，標(biāo)記以同位素、生物素、地高辛或熒光素，對(duì)外周血、腫瘤細(xì)胞或癌前組織的離散培養(yǎng)細(xì)胞的染色體鋪片或切片進(jìn)行DNA-DNA原位雜交，其雜交定位以熒光法、放射自顯影或免疫組化法顯示。目前ICA已廣泛應(yīng)用于生前診斷、腫瘤組織活檢材料的診斷和基因異常的診斷。在腫瘤細(xì)胞方面，在乳腺癌，神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、睪丸腫瘤，婦科腫瘤和膀胱腫瘤等均有實(shí)驗(yàn)報(bào)告�，F(xiàn)已能提供的DNA探針有染色體1，7，8，9，10，15，16，17，18和性染色體X、Y，以及識(shí)別一些染色體特征性部位如著絲點(diǎn)（centromeric region)、染色體端極區(qū)（telomere region)的特異性重復(fù)靶核苷序列和隨體的DNA探針，多數(shù)為合成的寡核苷酸探針，在應(yīng)用上采取ISHH和FCM以及免疫組化相結(jié)合（有時(shí)還結(jié)合核型分析)的綜合研究法（圖21-2)，也可用多種標(biāo)記物顯示不同顏色或不同標(biāo)記在一張切片上同時(shí)顯示多個(gè)染色體的結(jié)構(gòu)或DNA含量異常，如異硫氰酸熒光素（FITC)和羅丹明200結(jié)合，前者顯示黃綠色，后者顯示紅色，ABC-DAB顯示法與地高辛-堿性磷酸酶系統(tǒng)相結(jié)合，前者反應(yīng)物為棕色，后者為紫藍(lán)色。這種聯(lián)合應(yīng)用法又叫多靶點(diǎn)原位雜交法（multiple-target ISH)。
圖21-2 腫瘤組織處理流程圖
（二)本操作方法
1．玻片與組織前處理
�。�1)腫瘤細(xì)胞混懸液的制備：新鮮的從活檢或外科手術(shù)或尸檢獲得的材料建議按圖21-2的流程處理進(jìn)行綜合研究。用以制作細(xì)胞混懸液的組織在處理前可保存于液氮內(nèi)。組織塊在玻皿中切碎或用細(xì)胞打碎機(jī)打碎，用100μm孔直徑的尼龍網(wǎng)過(guò)濾器濾過(guò)，固定在70%乙醇，-20℃，如保存于-39℃可保存數(shù)月至數(shù)年。
�。�2)分離的細(xì)胞由于表面有細(xì)胞質(zhì)的覆蓋，在熒光顯微鏡下會(huì)顯示強(qiáng)烈的自動(dòng)熒光，從而掩蓋了ISHH的信號(hào)�？刹扇∠铝袃煞N方法移除覆蓋的細(xì)胞質(zhì)；
�、僖掖脊潭ê蟮募�(xì)胞，應(yīng)用以前在新鮮制備的甲醇/醋酸（3：1)固定液內(nèi)0℃，5min。滴2～3滴固定后的細(xì)胞混懸液于涂有粘附劑的載片上，空氣干燥，然后快速浸入70%醋酸內(nèi)10～60s。應(yīng)用蒸餾水洗，在100%乙醇內(nèi)脫水，空氣干燥。
②應(yīng)用胃蛋白酶蛋白水解作用。加5μl細(xì)胞混懸液于載片上，空氣干燥30min或在80℃烤箱中干燥。胃蛋白酶（2500～3500單位/mg蛋白質(zhì)，Sigma,USA)應(yīng)用0.01mol/L HCl稀釋至50～400μg/ml，10min 37℃；再用0.03% H2O2和PBS漂洗，以4%多聚甲醛固定，0℃，5min；載片脫水，空氣干燥，在80℃加熱變性30min。這個(gè)方法較①更好，能移除蛋白質(zhì)、暴露核DNA和有助于探針的穿透，最重要的能較好的保持形態(tài)學(xué)的結(jié)構(gòu)，以利于ISHH的熒光信號(hào)的顯示。應(yīng)用①法，細(xì)胞經(jīng)常呈扁盤狀，而且細(xì)胞質(zhì)的自動(dòng)熒光未完全消失，影響ISHH熒光信號(hào)的顯示，但實(shí)驗(yàn)表明，必須嚴(yán)格掌握胃蛋白酶的濃度，過(guò)低，由于細(xì)胞質(zhì)的覆蓋，基因拷貝數(shù)會(huì)減低，而過(guò)高濃度的胃蛋白酶會(huì)導(dǎo)致過(guò)度消化影響細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。醫(yī)學(xué).全在.線www.med126.com
�。�3)組織切片處理
�、倮鋬銮衅呵衅�5μm，放置有粘附劑的載片上，空氣干燥，固定在4%多聚甲醛-PBS溶液，0℃，15min。固定后以PBS和0.01n HCl漂洗，以胃蛋白酶（20～100μg/ml，用0.01N HCl配制)，37℃，30min，PBS漂洗2×5min，在4%多聚甲醛內(nèi)固定15min（0℃)，PBS洗2×5min，系列等級(jí)乙醇脫水，空氣干燥。雜交前，在80℃加熱30min使之變性。
�、谑炃衅呵衅�5μm，漂洗在40℃溫水中，撈片于有粘附劑的載片上，空氣干燥，56℃加熱1～16h，二甲苯脫蠟2×3min甲醇沖洗2×5min。應(yīng)用1%H2O2（用甲醇配)溶液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。以甲醇沖洗，空氣干燥，以胃蛋白酶（4mg/ml,用0.2n HCl配)37℃ 30min。消化后，載片以PBS沖洗。在雜交前，載片孵育于1%甘氨酸溶液-PBS中15min，以PBS沖洗和系列酒精脫水，空氣干燥。載片在80℃孵育30min使之變性。
2．雜交 本實(shí)驗(yàn)的雜交液略區(qū)別于其它實(shí)驗(yàn)，否則染色體1號(hào)和18號(hào)的DNA探針不僅結(jié)合1號(hào)和18號(hào)染色體，還會(huì)同時(shí)結(jié)合染色體9，6，13，21。雜交液配方：
甲酰胺 60%（V/V，2×SSC配，pH5.0)
鯡魚精子DNA 1μg/μl
余與一般雜交液配制相同
對(duì)多靶點(diǎn)ISHH，須另加入1mmol/L KCN入雜交液，每張載片加5μl的含特異性DNA探針（2.5ng/μl)的雜交液，以蓋片覆蓋，四周用橡皮泥封固，先在80℃熱板上5～10min使DNA變性，細(xì)胞混懸液制片變性時(shí)間只需2.5min，然后在37℃雜交，孵育過(guò)夜。
3．雜交后漂洗同本節(jié)�。ǘ�)雜交后漂洗步驟。
4．顯示步驟根據(jù)標(biāo)記物的種類（同位素、熒光素、生物素或地高辛)分別進(jìn)行顯示（與第二十章 中敘述相同)。
5．結(jié)果在光鏡下可見(jiàn)染色體結(jié)構(gòu)的改變，如在膀胱腫瘤細(xì)胞，其DNA含量經(jīng)FCM顯示高于正常組織1倍，在雙靶ISHH顯示載片上，可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞間期核內(nèi)，1號(hào)染色體為3倍體，而18號(hào)染色體為2倍體。在腫瘤細(xì)胞內(nèi)應(yīng)用雙重靶點(diǎn)或多重靶點(diǎn)ISHH技術(shù)可見(jiàn)細(xì)胞間期核內(nèi)多個(gè)染色體的眾多畸變相。
ISHH技術(shù)作為一項(xiàng)快速與敏感的偵檢細(xì)胞間期細(xì)胞核內(nèi)染色體畸變的新技術(shù)，可結(jié)合病理材料的常規(guī)組織切片、免疫組化染色和FCM等對(duì)病檢材料做出早期的、準(zhǔn)確的診斷，并對(duì)腫瘤的預(yù)后與進(jìn)展等有所了解。本技術(shù)成功的關(guān)鍵在于具有特異性的DNA探針和ISHH的偵檢程序，比如染色體的拷貝數(shù)與腫瘤細(xì)胞前處理的方法有關(guān)，如移除蛋白質(zhì)不徹底，就會(huì)使偵檢到的染色體拷貝數(shù)減少。又如在切片上進(jìn)行細(xì)胞間期染色體的ISHH時(shí)，常見(jiàn)到一些細(xì)胞核碎片呈不同形狀的斑點(diǎn)狀（在涂片上不會(huì)出現(xiàn)此種圖像)。對(duì)ISHH所獲得資料的分析，須經(jīng)過(guò)反復(fù)的實(shí)踐，比如模糊的或分裂的斑點(diǎn)可以是非整倍體（aneuoploidy)的假陽(yáng)性反應(yīng)，產(chǎn)生于細(xì)胞周期的G2期。
