（四)外周血培養(yǎng)及染色體制片技術(shù)
1．國內(nèi)應(yīng)用的外周血培養(yǎng)染色體技術(shù)
�。�1)原理：外周血染色體制備是目前應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞遺傳學(xué)診斷技術(shù)，亦是基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，由于取材容易，培養(yǎng)過程比較簡單，短期內(nèi)可以得到結(jié)果，所以其實(shí)用價(jià)值很高。
血液中含有紅、白兩類細(xì)胞，它們均是處于未分裂的間期細(xì)胞。紅細(xì)胞沒有核，無分裂能力；白細(xì)胞類雖有細(xì)胞核存在，但是外周血中處于休止期。植物血球凝集素（簡稱PHA)能促使淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有分裂作用的母細(xì)胞。染色體只有在細(xì)胞分裂中期時(shí)最典型。秋水仙素類藥的藥物能抑制紡錘絲的形成，使細(xì)胞分裂停止于中期，低滲處理使細(xì)胞膨脹，細(xì)胞膜破裂，染色體分散，這樣就可便于分析。
簡意流程圖：
（2)操作過程
�、俨裳簾o菌干針筒從靜脈取血1～2ml，用肝素抗凝（約每毫升全血內(nèi)含肝素100單位)。
�、谂囵B(yǎng)液配制：RPMI 1640 4ml
小牛血清 1ml
1%PHA（自制)0.2ml
調(diào)節(jié) pH為7.4后置于-20℃冰箱
③標(biāo)本接種：每5ml培養(yǎng)液加入抗凝全血0.5ml。
�、芘囵B(yǎng)細(xì)胞：將接種好的培養(yǎng)瓶置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)72h。
�、葑柚狗至眩号囵B(yǎng)至68h，加秋水仙素，最終濃度0.02μl/ml，搖勻后置于37℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。
�、奘斋@：培養(yǎng)物混合后，置于10ml離心管內(nèi)，離心10min（1000轉(zhuǎn)/min)，去上清液。留下培養(yǎng)物。
�、叩蜐B處理：低滲液可用0.56%的KCl（或0.075mol/l KCl)5～7ml，用吸管打散沉淀物，置于37℃水浴箱中保溫20min，然后加入固定液（3份甲醇：1份冰乙酸)1ml用吸管打勻，預(yù)固定1～2min。
�、嚯x心：1000轉(zhuǎn)/min離心10min。
⑨固定：吸去上清液，留下沉淀加上述固定液6～8ml，用吸管將沉淀物打散，固定30min后離心，1000轉(zhuǎn)/min離心10min，取出吸去上清液留下沉淀。
�、庵貜�(fù)上述固定離心1次。
�、蠘�(biāo)本制作：最后1次固定、離心后吸去上清液，留下沉淀再加少量新鮮固定液約0.3ml打散細(xì)胞懸浮液即可進(jìn)行制片。制片之前先將載玻片經(jīng)清潔液洗凈處理后，置于冰箱內(nèi)制成冰片。取冰片1張滴上2～3滴細(xì)胞懸液。利用冰片的表面張力關(guān)系使液體迅速向玻片四周散開，與此同時(shí)用嘴輕輕吹向滴片處，以助其更快散開，然后在酒精燈火上通過7～8次后，自然干燥或烤干均可。醫(yī)學(xué).全.在線.網(wǎng).站.提供
⑿染色：Giemsa染液1份和pH7.4磷酸緩沖液9份，混合后，染色20min，蒸餾水洗去余下染液，晾干，鏡檢觀察。
�。�3)注意事項(xiàng)
�、贌o菌操作是關(guān)鍵。培養(yǎng)液不得污染。
�、谒盟幤凡坏檬В貏e是PHA，既要使淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，又不能過量。
�、坌∨Ｑ鍍�(yōu)質(zhì)、無菌。
�、芮锼汕逅氐蜐舛�4～6h效果最佳，過量則染色體易收縮。
�、莨潭ㄒ汉虶iemsa染液要求新鮮配用。
⑥培養(yǎng)時(shí)間72h較好。
�。�4)各種物品清洗與消毒
①玻璃器皿用后，立即用自來水沖洗，再用洗衣粉刷洗，然后用自來水沖洗。待干，泡入清潔液24～48h，取出，自來水沖洗，再用雙蒸水沖洗，干后備用。
�、诮佑|洗液時(shí)，帶上橡皮手套，圍裙等防護(hù)品。
常用清潔液配制：
重鉻酸鉀25g
水200ml
濃硫酸1000ml
③先將重鉻酸鉀在水中溶解，然后慢慢加入濃硫酸，邊加邊攪拌，防止過度發(fā)熱。使用3～6月后檢查，若變綠表示失效。
④G5、G6漏斗的處理：水洗凈、晾干，于濃硫酸泡（或洗液中泡)24h，再用蒸餾水沖洗至加入1%BaCl2滴無白色沉淀為止。包裝消毒，15磅20min。
�。�5)橡皮塞的處理
新的橡皮塞洗后，先用0.5N NaOH煮沸15min，再用0.5n HCl煮沸15min，流水沖洗10min，用雙蒸水泡24h，雙蒸水沖洗，晾干，15磅20min高壓滅菌。
�。�6)金屬器械清洗
先用紗布或紙擦去防銹油，然后用洗滌液清洗，再用清水或蒸餾水洗凈，擦干或烘干備用。
2．外周血細(xì)胞培養(yǎng)法（Bhatt B and McGee JOD,1990)
（1)收集靜脈血（無菌)，加肝素抗凝（20單位/ml)；
（2)加0.8ml全血入每個(gè)培養(yǎng)瓶（含10ml培養(yǎng)液)，37℃培養(yǎng)72h；
培養(yǎng)液配制：RPMI 76ml(Gibco,Cat.No.041-1875M)
小牛血清 20ml
PHA 2.0ml
（3)加100μl Brdu于培養(yǎng)瓶中，37℃再孵育16～17h；
（4)離心（1200rpm)8min，棄去上清液，沉淀中加入10ml RPMI 1640培養(yǎng)液，混勻；
�。�5)重復(fù)步驟（4)；
（6)沉淀中加入10ml新配制的完全培養(yǎng)液（含2.5μg/ml胸腺嘧啶)，重新置于37℃孵育6～7h；
�。�7)在收獲培養(yǎng)細(xì)胞前15～30min，可加Colcemid,但當(dāng)同時(shí)應(yīng)用BrdU時(shí)這就并非十分必要。因?yàn)锽rdU是胸腺嘧啶核苷的類似物，能使染色體在富含異染色質(zhì)處斷裂分解，從而使顯帶明顯；
�。�8)1200rpm離心培養(yǎng)細(xì)胞，棄去上清液，加入1ml 0.56% KCl（事先預(yù)熱至37℃)，繼續(xù)加入0.56%KCl使總?cè)萘窟_(dá)到10ml，在37℃孵育10min；
（9)如上述離心，棄去上清液，在沉淀的細(xì)胞內(nèi)加入新鮮的冷固定劑，（甲醇：冰醋酸=3：1，新鮮配制，保存在冰上)，置冰上至少20min；
�。�10)重復(fù)步驟（9)3～4次，直至細(xì)胞懸液清潔無色；
�。�11)可較長期保存在冰的固定劑內(nèi)（-20℃)或再離心后加入0.5～1.0ml新鮮固定劑，置于冰上；
�。�12)玻璃載片放在Decon（清潔液)或其它的清潔液內(nèi)過夜，次日用自來水沖洗，繼之蒸餾水漂洗，在60～75℃干燥，然后把載片孵育在2%丙酮液內(nèi)，室溫，60min。自來水沖洗，再在60～75℃干燥；
�。�13)每張載片上加10μl的細(xì)胞混懸液，空氣干燥，在24h后可應(yīng)用于雜交實(shí)驗(yàn)，也可保存在-4℃達(dá)8周之久（試劑配制法見附錄四)。
