二、應用ISHH技術對染色體制片、基因分配（Chromosomal assignment of genes)的研究
�。ㄒ�)基本原理
染色體上基因位置分配的研究，又叫染色體圖的研究，包括基因名稱、基因在染色體的位置及與相鄰基因的距離及其核酸序列的研究。研究基因圖的方法包括家系的連鎖分析法、體細胞雜交法、重組DNA技術和原位雜交法。果蠅的線形基因圖和大腸桿菌、T4噬菌體兩者的環(huán)狀基因圖都已繪成，目前正致力于人類基因圖的繪制。人類基因約有5萬～10萬個，根據(jù)第八次國際人類基因定位工作會議，已定位的人類基因總數(shù)達1479個。
ISHH技術對染色體基因圖的研究，是用同位素或生物素、地高辛標記的核酸探針，直接同中期的染色體鋪片行雜交。早期的研究是用于重復序列DNA的定位，如編碼核糖體的基因18S和28S核糖體RNA定位于第13～15號染色體和第21～22號染色體短臂次縊痕區(qū)。5S核糖體RNA定位于第1號染色體上長臂的遠側(cè)Iq42～Iq43。近年已能進行單拷貝基因的定位，如胰島素基因定位于IIp 15上、C-mos原癌基因定位于Sq22上、N-ras原癌基因定位于IPI34。在染色體11的短臂上，利用ISHH技術證明4個基因依次排列，從短臂的遠端依次為胰島素、β-球蛋白、HRASI和PTH。
�。ǘ�)操作步驟（Bhatt and MCGee, 1990)
在前面已介紹了制備血培養(yǎng)染色體鋪片的方法。下面介紹的是在染色體制片上用免疫金銀染色法進行原位雜交的基因定位顯示、結(jié)合Giemsa染色顯帶技術的操作步驟。
1．移除內(nèi)源性RNA
�。�1)加100μl RNA酶溶液，覆以蓋玻片，放在有少許2×SSC溶液的濕盒內(nèi)孵育，37℃，60min。
�。�2)在2×SSC溶液內(nèi)移除蓋玻片，以2×SSC洗2×3min。
（3)等級酒精系列脫水，10%，50%，70%，90%和100%，各1min，各1min�？諝飧稍铩�
2．探針標記和純化用缺口平移法將生物素11-dUTP標記在DNA核酸探針上。
3．變性與雜交
加20～100ng生物素標記探針到雜交液中，加入5μl 20mg/ml人或鯡魚精子DNA，總?cè)萘繛?0～40μl，離心5s，混勻后，滴于染色體鋪片，覆以蓋玻片，蓋片四周以橡皮泥封固。放入盛2×SSC溶液溫盒內(nèi)75℃7～8min，使之變性，繼之于37℃孵育16h。
4．雜交后漂洗2×SSC溶液內(nèi)移除蓋玻片，將載片浸入含50%甲酰胺的2×SSC溶液內(nèi)，pH7.2,20min,42℃。然后作下列程序漂洗
溶液 漂洗時間 溫度
2×SSc 20min 42℃
1×SSC 20min 室溫
0.1×SSc 20min 室溫
5．免疫細胞化學顯示
�。�1)孵育載片于PBt 15min，將片緣及背面擦干，加100μl一抗于載片（兔抗生物素抗血清1：100，以PBT稀釋)，孵育于37℃40～60min。
�。�2)快速用PBT沖洗，擦干片緣及背面，加100μl二抗抗血清（羊抗兔IgG結(jié)合10～20nm金粒，以PBT1：50稀釋)于載片染色體鋪片部位，37℃孵育45～60min。
�。�3)PBS洗3×5min。
�。�4)蒸餾水洗3×5min。
�。�5)加數(shù)滴銀溶液于載片上，在光鏡下監(jiān)測，大約需5～18min可見在染色體上出現(xiàn)銀斑點。
�。�6)蒸餾水洗。PBT配制見附錄3。
6．顯帶復制（Replication banding)
（1)應用5μg/ml Hoechst 33258在2×SSC溶液內(nèi)，暗室中染載片20min。
�。�2)蒸餾水洗，以2×SSC封固，覆以蓋玻片，蓋片四周封以橡皮泥。
�。�3)紫外光照射1～16h。
（4)蒸餾水洗和以10%Giemsa（磷酸緩沖液稀釋，pH6.8～7.2)染色10min。
�。�5)蒸餾水沖洗，空氣干燥，以DPX封固。
�。�6)光鏡下觀察，可見棕色的銀斑點在染色體上的定位，并顯示其與染色體分帶的關系。
