DNA重組實(shí)驗(yàn)中常用的技術(shù)

　　（二)大腸桿菌感受態(tài)的制備及重組DNA的轉(zhuǎn)化

　　1．感受態(tài)的制備

　�。�1)接種單菌落于2ml LB培養(yǎng)液中， 37℃過(guò)夜。

　�。�2)取0.25ml過(guò)夜菌入25ml LB培養(yǎng)液中，37℃振搖4～6h至A₅₉₀=0.4～0.6。

　�。�3)倒入50ml管內(nèi)，水浴10min，以2500～3000rpm離心5min，棄上清。

　�。�4)緩慢加入75mmol/L預(yù)冷CaCl₂5ml懸浮菌體，冰浴20min，同上離心棄上清。

　�。�5)緩慢加入75mmol/L預(yù)冷CaCl₂1.0ml輕輕混勻后分裝在1.5ml Eppendorf管中，每管200μl，冰浴1～2h。

　　2．重組DNA的轉(zhuǎn)化

　�。�1)將3只Eppendorf管按下列轉(zhuǎn)化項(xiàng)目作好標(biāo)記，然后按下述進(jìn)行：

　　（2)冰浴30min至1h。中間搖動(dòng)3次，以防受體菌沉底。

　　（3)42℃90s。

　　（4)37℃水浴5min。

　�。�5)加入無(wú)相應(yīng)抗生素的Lb 200μl，混勻后，37℃水浴30～60min。

　�。�6)分別取3組反應(yīng)物各50μl在含相應(yīng)抗生素的固體LB培養(yǎng)基平皿上涂布，室溫下干燥，然后倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)過(guò)夜。

　�。ㄈ�)轉(zhuǎn)化子DNA的快速鑒定－快速細(xì)胞破碎法

　�。�1)挑取轉(zhuǎn)化平板上的單菌接種于含相應(yīng)抗生素的2ml LB中，37℃振蕩培養(yǎng)至A₅₉₀值為0.6～0.8。

　　（2)取1ml菌液至1.5ml Eppendorf管中，9000rpm離心9min，去盡上清。

　�。�3)加入70μl Cracking Gel緩沖液[1mol/L Tris –HCl(pH6.8)10ml,20%SDS 10ml, 250mmol/L EDTA 1.6ml,蔗糖27.2g, 1.2%溴酚藍(lán)1.67ml，加雙蒸水至200ml]，混勻后，37℃水浴30min以上。

　�。�4)15000rpm離心15min。

　�。�5)吸取上清點(diǎn)樣電泳，觀察。

　　（四)轉(zhuǎn)化子DNA的酶切鑒定

　　1．轉(zhuǎn)化子DNA的快速少量抽提

　�。�1)同本節(jié)　二.（三).1.

　�。�2)菌液移至5ml Eppendorf 管中，9000rpm,離心9min，去上清。

　�。�3)加溶液Ⅰ100μl，溶液Ⅱ200μl，溶液Ⅲ150μl，混勻，冰浴10min。

　　（4)15000rpm離心15min。

　　（5)吸取上清，加入異丙醇1ml混勻，置室溫15～30min。

　　（6)15000rpm離心15min，棄上清，加入75%乙醇洗滌2次。

　�。�7)離心棄上清，真空抽干，加入適量1×TE溶解DNA。

　�。�8)取少量DNA電泳，觀察濃度。

　　2．轉(zhuǎn)化子DNA的小量酶切鑒定　　同質(zhì)粒DNA的小量酶切鑒定，見(jiàn)本節(jié)　一（三)。

　�。ㄎ�)重組子DNA的進(jìn)一步鑒定

　　可用Southern印跡雜交法或斑點(diǎn)雜交法等進(jìn)一步鑒定，詳見(jiàn)本節(jié)　四。

　　[附]電泳洗脫法回收酶切DNA片段

　　（1)用合適的酶切割DNA并電泳。

　�。�2)于紫外燈下從凝膠上切下所要的DNA帶，裝入含1×TBE緩沖液的透析代內(nèi)，用夾子封好袋口，并檢查有無(wú)漏孔。

　�。�3)將透析袋（縱長(zhǎng))與兩極間的邊線垂直放于電泳槽內(nèi)電泳，4～5V/cm電泳至DNA貼緊袋壁。

　　（4)取出透析袋，擠出凝膠塊，吸出袋內(nèi)液體放入1.5ml的離心管內(nèi)，10000rpm離心5min。

　�。�5)吸出上清放入離心管內(nèi)，加入等體積的飽和酚和等體積的氯仿，振蕩混勻，10000rpm離心5min，吸出上清放入新的離心管內(nèi)。

　�。�6)加入1/10體積的3mol/L AaAc,2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，于-20℃放置4～5h。

　　（7)于4℃，10000rpm離心15min，棄上清。

　�。�8)用75%的酒精洗滌2次，每次均于4℃，10000rpm離心5min，棄上清。

　�。�9)真空抽干，并用適量1×TE溶解沉淀。如此即得所需DNA片段。

　　三、地高辛配基隨機(jī)標(biāo)記DNA探針?lè)?/P>

　　（一)概述

　　基因診斷是以核酸分子雜交技術(shù)為基礎(chǔ)，在核酸水平檢測(cè)人類(lèi)遺傳性疾病的基因缺陷和一些傳染病病原體的方法。其基本過(guò)程是：制備DNA探針，標(biāo)記探針，檢測(cè)樣本。開(kāi)展這項(xiàng)工作的關(guān)鍵是要得到高靈敏度、高特異性的探針。以往人們是用放射性同位素來(lái)標(biāo)記探針DNA。近年來(lái)，非同位素標(biāo)記方法發(fā)展很快，已有取代同位素標(biāo)記法的趨勢(shì)。地高辛配基隨機(jī)標(biāo)記DNA探針?lè)�，是較為成功的一種非同位素標(biāo)記方法。其原理是：用化學(xué)方法把類(lèi)固醇類(lèi)半抗原地高辛分子連接在dUTP上（Dig-dUTP)。用隨機(jī)引物及DNA多聚酶，以探針DNA為模板，合成互補(bǔ)DNA，化學(xué)修飾過(guò)的dUTP同時(shí)摻入到標(biāo)記的DNA探針中。雜交后用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛單抗與標(biāo)記探針DNA中的Dig-dUTP結(jié)合，加入顯色底物，在堿性磷酸酶作用下，轉(zhuǎn)變成深棕色或藍(lán)色的化合物。

　　1．標(biāo)記　本試劑盒采用隨機(jī)引物標(biāo)記方法，可標(biāo)記少至10ng，多至3μg的DNA。能在新合成的DNA鏈每20～25個(gè)核苷酸，摻入一個(gè)Dig-dUTP，反應(yīng)時(shí)間約為1h。

　　2．雜交　按標(biāo)準(zhǔn)雜交方法進(jìn)行�？梢圆捎媚猃埬せ蛳跛崂w維素膜。用過(guò)的雜交液可凍存于-20℃，重復(fù)使用。

　　3．免疫學(xué)檢測(cè)　封阻后，檢測(cè)反應(yīng)的第一步，抗體結(jié)合物與標(biāo)記DNA結(jié)合，出現(xiàn)雜交的半抗原-標(biāo)記DNA，顯色反應(yīng)起始是在堿性pH條件下加入無(wú)色的顯色劑X-磷酸鹽和NBT，在幾分鐘內(nèi)便開(kāi)始出現(xiàn)藍(lán)色，顯色反應(yīng)的過(guò)程持續(xù)3d。典型的例子是在24h后終止顯色反應(yīng)。用二甲基甲酰胺洗掉尼龍膜上的顏色后，尼龍膜可重新用于雜交。

　　4．應(yīng)用　地高辛配基標(biāo)記DNA探針及檢測(cè)試劑盒，能檢測(cè)0.1pg的同源DNA，能檢測(cè)1μg哺乳動(dòng)物DAN中的單拷貝基因，與放射性標(biāo)記系統(tǒng)比較，此試劑盒能快速得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果（從DNA的標(biāo)記和雜交至見(jiàn)到檢測(cè)結(jié)果24h內(nèi)能完成)，而且消除了放射性的不安全問(wèn)題。這試劑的靈敏度與特異性使它適用于所有的雜交技術(shù)（包括DNA-印跡轉(zhuǎn)移，菌落雜交，噬菌斑雜交及原位雜交)以替代同位素標(biāo)記和放射自顯影術(shù)。

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