2)酶解法肽譜重迭法
分析肽段也可采用酶解法，利用專一性不同的兩種酶將一個(gè)肽分別斷裂成更小的寡肽，比較兩種方法所得之肽段的重復(fù)性，進(jìn)行氨基酸順序的裝配。例如，有一個(gè)肽段，通過氨基酸組成分析已知其為十肽，假如先以糜蛋白酶水解，則得到一套寡肽，再以胰蛋白酶水解此十肽，得到另一套寡肽。分析結(jié)果如下：
Ala·Phe+Gly·Lys·Asn·Tyr+Arg·Trp+His·Val
糜蛋白酶水解
+肽(Ala·Phe·Gly·Lys·Asn·Tyr·Arg·Trp·His·Val)
胰蛋白酶水解
Ala·Phe·Gly·Lys+Asa·Tyr·Arg+Trp·His·Val
將此兩套寡肽可以做分析比較，因?yàn)槭牡腘末端及C末端已事先測(cè)定分別為Ala及Val，因此第一段寡肽必然是Ala,Phe。如此類推如下
| 寡肽號(hào) | 氨基酸組成部分順序 |
| A-1 | Ala·Pha |
| B-1 | Ala·Phe·Gly·Lys |
| A-2 | Gly·Lys·Asn·Tyr |
| B-2 | Asn·Tyr·Arg |
| A-3 | Arg·Trp |
| B-3 | Trp·His·Val |
| A-4 |
His·Val |
| 十肽順序 | Ala·Phe·Gly·Lys·Asn·Tyr·Arg·Trp·His·Val |
水解酶也可運(yùn)用二肽酶，兩組可用同一種酶水解如第一套肽是A桞，C桪，E桭，G桯……第二套肽水解則先將該肽段N端切去一個(gè)末位氨基酸，然后再開始二肽酶斷裂，結(jié)果是A，B桟，D桬，F(xiàn)桮……這樣分析比較也可排列出肽段順序。
5.二硫鍵定位
蛋白質(zhì)分子不經(jīng)任何處理，直接用酶水解，檢出其中二硫鍵的肽段，然后將二硫鍵拆開，分別測(cè)定兩個(gè)肽的順序，將此兩肽結(jié)構(gòu)與測(cè)出的一級(jí)結(jié)構(gòu)比較，就能找出相應(yīng)的二硫鍵的位置。
含二硫鍵肽的檢出方法。
1)凝膠過濾或離子交換層析：用以分離各肽段，然后用特殊的二硫鍵顯色反應(yīng)找出含二硫鍵的肽。
圖1-21 對(duì)角線電泳技術(shù)圖解
2)對(duì)角線電泳或?qū)游觯?966年Brown及Hartlay提出用對(duì)角線電泳進(jìn)行含－S-S-肽的定位，此方法是將水解后的肽混合物進(jìn)行第一相電泳，樣品點(diǎn)在中間，電泳畢，將樣品紙條剪下，置于裝有過甲酸的器皿中，用過甲酸蒸氣處理2小時(shí)，使-S-S-斷裂，此時(shí)含-S-S-肽段的靜電荷發(fā)生了改變。然后將紙條縫于另一張紙上，進(jìn)行第二相電泳電泳，電泳條件與第一相相同，只是與第一次方向成直角。在第二相電泳中，那些不含-S-S-的髣民泳情況與第一相相同，因此電泳后各肽斑均坐落在紙的對(duì)角線上，而那些含-S-S-的肽由于被氧化，電荷發(fā)生變化，第二相電泳速度就與第一相不同，電泳結(jié)果這些肽斑就偏離對(duì)角線，肽斑可用茚三酮顯示。對(duì)角線法由于其速度快，操作簡(jiǎn)便以及能用于小分子樣品，是直接分離-S-S-肽的好方法。
含-S-S-肽被分離后，即可進(jìn)行肽段順序分析，并與已測(cè)定的該蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，即可找出相應(yīng)的-S-S-位置，至此蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)基本闡明。
今后蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定正朝自動(dòng)化、快速化及微量化發(fā)展，關(guān)鍵問題仍然是進(jìn)一步尋找蛋白裂解和肽分離的方法。
蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定不斷有新方法和新思路出現(xiàn)，如X衍射法測(cè)定一級(jí)結(jié)構(gòu)；分離相應(yīng)蛋白質(zhì)的mRNA，由mRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)排出蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)等。這些大膽的設(shè)想必將有助于蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定，使人們掌握更多的工具和方法去探索生命的奧秘。
