中國(guó)幽門螺桿菌研究:幽門螺桿菌感染診斷方法的進(jìn)展

1983年從慢性活動(dòng)性胃炎病人活檢標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)以來(lái)，對(duì)Hp和Hp感染的研究進(jìn)展神速�，F(xiàn)在已清楚Hp與許多種慢性胃�。˙型胃炎，消化性潰瘍，胃癌等)關(guān)系密切，且成為它們重要的致病因子。目前臨床上為求得根治B型胃炎，消化性潰瘍等慢性胃病的療效，已越來(lái)越傾向于采用以抗Hp感染療法為主，再輔以其他對(duì)癥療法。因此如何正確考核抗Hp療效即成為一個(gè)重要問(wèn)題，這就涉及到如何正確使用現(xiàn)有的各種診斷方法。本文擬對(duì)現(xiàn)有的Hp感染診斷方法作一介紹，以供不同的臨床條件合理選用。

作為一種理想的診斷方法當(dāng)然應(yīng)有高度的敏感性和特異性，對(duì)病人僅有最小的侵襲性或者根本沒(méi)有損害性，操作簡(jiǎn)單方便，僅需常規(guī)的技術(shù)和設(shè)備，費(fèi)用也不太貴，易被病人所接受，無(wú)疑這樣理想的試驗(yàn)仍然有待設(shè)計(jì)。盡管現(xiàn)有的各種方法還各有缺點(diǎn)，然而采用這些診斷方法已經(jīng)為弄清Hp感染的自然史及流行病學(xué)提供了大量信息�？磥�(lái)，今后在準(zhǔn)確診斷Hp感染，考核抗Hp療效和研制抗Hp的新藥等過(guò)程中仍需應(yīng)用這些診斷方法。

1　組織細(xì)胞學(xué)方法：

1.1　光鏡法

在Marshall和Warren的報(bào)告一、二個(gè)世紀(jì)之前已有人發(fā)現(xiàn)胃內(nèi)存在細(xì)菌，之所以一直未被重視是因?yàn)榻M織切片中所見(jiàn)的細(xì)菌往往是可疑的和多變的，事實(shí)上傳統(tǒng)的HE染色被認(rèn)為證明Hp是不可靠的，因?yàn)樵诨顧z標(biāo)本中檢測(cè)Hp大大地受到所用染色法的種類和標(biāo)本的采集兩方面因素影響。

Hp特征性的形態(tài)表現(xiàn)是3.0um×0.5um螺旋狀彎曲的細(xì)菌，定位于胃上皮細(xì)胞的表面或鄰近，迄今沒(méi)有一種所用的染色法是特異的（除非Mab染色)。一般染色法僅靠細(xì)菌的形態(tài)特征及定居部位判斷，常規(guī)使用的HE染色也可以籍此識(shí)別Hp感染者，但必需具有豐富經(jīng)驗(yàn)。凡是未能在HE染色下見(jiàn)到時(shí)可以建議進(jìn)一步用其它染色方法，例如用Warthin-Starry鍍銀染色，使它更為明顯。由于這一原因，鍍銀染色法盡管技術(shù)要求較高，費(fèi)用較貴，還是得到較廣泛采用，價(jià)廉的常規(guī)應(yīng)用的Giemsa染色可獲得類似的效果，亞叮橙熒光染色也比較簡(jiǎn)便有效，但需要有熒光顯微鏡，溴化乙錠，Gimenez和Hopps-Brown染色；相差顯微鏡；熒光抗體的免疫組織學(xué)方法也有人使用，但是似乎并不比常規(guī)使用的方法有更多優(yōu)點(diǎn)。

除了所有的染色方法外，第二個(gè)影響組織學(xué)檢驗(yàn)Hp的因素是細(xì)菌在整個(gè)胃粘膜上分布的不均一性，特別是在胃體和噴門部位易出現(xiàn)斑片狀分布，雖然胃竇部位分布較均勻，一塊活檢標(biāo)本仍有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。事實(shí)上每一塊不同來(lái)源活檢標(biāo)本上可觀察到的細(xì)菌數(shù)有相當(dāng)大的差異，一般認(rèn)為，離幽門5cm部位至少采用兩塊活檢標(biāo)本才能滿足診斷更求。活檢標(biāo)本作組織學(xué)檢查的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是有機(jī)會(huì)同時(shí)去評(píng)估炎癥反應(yīng)的微觀證據(jù)，因?yàn)樵谌庋塾^察不存在粘膜異常時(shí)可能出現(xiàn)組織學(xué)胃炎，這一檢查可說(shuō)明Hp的出現(xiàn)和炎癥之間的相關(guān)性。另外，沒(méi)有找到Hp的組織學(xué)慢性胃炎應(yīng)當(dāng)小心的重復(fù)檢查切片以排除細(xì)菌感染。由此，胃活檢的組織學(xué)檢查能提供關(guān)于Hp的存在和胃粘膜病情相關(guān)的重要信息，雖然，需要作胃鏡檢查（有一定損傷性，患者多在不得以情況下接受這一檢查)是這一診斷方法上的障礙，但活檢標(biāo)本在有臨床指征作胃鏡時(shí)是很容易獲得的。

1.2　電鏡法

可分透射電鏡和掃描電鏡兩種，而前者的超薄切片法對(duì)臨床診斷更有價(jià)值。①通過(guò)電鏡可觀察Hp的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征及與胃粘膜上皮細(xì)胞間的關(guān)系，更易確證Hp感染；②同時(shí)也可以觀察到胃上皮細(xì)菌表面和內(nèi)部的微細(xì)病理變化及與各類炎癥細(xì)胞間的關(guān)系。這一方法由于受到設(shè)備條件限制，可能更費(fèi)時(shí)、費(fèi)事、費(fèi)錢，另外它也不可能避免Hp在胃粘膜上分布不均一性的影響。

2　微生物學(xué)方法

2.1　直接鏡檢法

這是一種簡(jiǎn)便易行的方法。只要取一塊活檢標(biāo)本在玻片上作涂片，經(jīng)革蘭染色，即可在油鏡下觀察，由于革蘭染色為一細(xì)菌鑒別染色法，放大倍數(shù)較組織學(xué)方法常用倍數(shù)為大，細(xì)菌形狀特征較明顯，因此，準(zhǔn)確性較高。

2.2　快速尿素酶試驗(yàn)

構(gòu)成幾種診斷Hp感染試驗(yàn)基礎(chǔ)的一個(gè)重要特征是這個(gè)細(xì)菌產(chǎn)生尿素酶的能力特別強(qiáng)。尿素酶降解尿素成氨與CO₂，使周圍培養(yǎng)基pH升高，因此活檢標(biāo)本中的Hp能籍pH指示劑顯色而檢測(cè)到，最早檢測(cè)Hp的尿素酶試驗(yàn)采用Christensen2％尿素肉湯，它是一種標(biāo)準(zhǔn)的微生物學(xué)試劑，用于尿素酶產(chǎn)物的測(cè)定，在這個(gè)理論基礎(chǔ)上已發(fā)展了許多變化，范圍從自已能配制的尿、酚紅指示劑水溶液到商品化的CLOTest試劑盒等。目前常用的快速尿素酶制劑通常在活檢標(biāo)本放入后幾分鐘內(nèi)即可顯示，?

■［此處缺少一些內(nèi)容］■

化酶（＋)，進(jìn)一步可用種特異的單克隆抗體免疫斑點(diǎn)染色作檢定。另一個(gè)需要注意的問(wèn)題是Hp活檢標(biāo)本長(zhǎng)期暴露在大氣中易死亡，因此應(yīng)即時(shí)臨床接種或?qū)��?biāo)本存放于運(yùn)輸培養(yǎng)液中運(yùn)送，及時(shí)送檢。

與組織學(xué)檢驗(yàn)方法一樣，Hp的不均勻分布可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果，從理論上講，這似利不應(yīng)成為問(wèn)題，因?yàn)橐粋�(gè)活菌即能形成一個(gè)菌落，實(shí)際上因?yàn)榫�落非常�?xì)小，或因被雜菌遮蓋，很難絕對(duì)避免疏忽遺漏，其他涉及Hp分離培養(yǎng)有成功的因素還可能包括：患者近期應(yīng)用了抗生素；作胃鏡檢查時(shí)攝入了局部麻醉藥；活檢鉗污染了雜菌或戊二醛等。

當(dāng)前在治療慢性胃炎、消化性潰瘍等慢性胃病以抗菌療法為主的形勢(shì)下，為了幫助選擇合適的抗Hp藥物，需做藥敏試驗(yàn)，通過(guò)培養(yǎng)方法獲得患者自身菌株是任何其他方法所不能取代的。Etest的出現(xiàn)簡(jiǎn)化了原先MIC測(cè)定的步驟。

上述三種微生物學(xué)檢查方法可以說(shuō)是各種其他檢查方法的基礎(chǔ)，在每發(fā)展一種新方法常需以之對(duì)照，尤其是直接涂片鏡檢和分離培養(yǎng)，因此有人曾稱之為“金標(biāo)準(zhǔn)”。

3　同位素示蹤方法

這一類方法主要是利用讓患者口服同位素標(biāo)記的尿素，以觀察胃中Hp分解尿素的能力，籍此判斷患者是否感了Hp及其感染的程度，這類試驗(yàn)現(xiàn)有兩類三種。

3.1　呼氣試驗(yàn)

這一類試驗(yàn)首先是Graham根據(jù)上述道理設(shè)quanxiangyun.cn/zhicheng/計(jì)，于1987年首次報(bào)道的。他用的是穩(wěn)定性同位素¹³C標(biāo)記的尿素，讓患者口服后，尿素在胃中接觸Hp的尿素酶后分俀成¹³CO₂，測(cè)定其在CO₂總呼出量中所占的濃度，以判斷胃中是否感染了Hp和感染的程度。這一種方法的最大優(yōu)點(diǎn)是：①體內(nèi)測(cè)定胃內(nèi)感染Hp的總體情況，避免了活檢標(biāo)本Hp分布不均造成的假陰性的結(jié)果；②¹³C是一種穩(wěn)定性同位素，所以對(duì)機(jī)體是完全無(wú)損傷性的；③它除了定性以外，還可做定量測(cè)定。它的最大弱點(diǎn)是需用氣體同位素質(zhì)譜儀測(cè)定，這種設(shè)備是一般醫(yī)院內(nèi)不具備的貴重儀器，再加上¹³C是稀有元素，因此測(cè)試費(fèi)用較貴。后來(lái)Bell設(shè)計(jì)了用¹⁴C標(biāo)記的尿素讓患者口服，用閃爍掃描儀測(cè)定患者呼出的¹⁴CO₂，這種儀器在有核醫(yī)學(xué)科的醫(yī)院中一般都有，因此在醫(yī)院中測(cè)定較方便。但是¹⁴C是一種放性同位素，盡管它的價(jià)格不是太貴，射線也不是太強(qiáng)，但它的半衰期有5000⁺a，一旦被機(jī)體攝入，有可能對(duì)機(jī)體造成慢性的長(zhǎng)期的內(nèi)照射損傷，因此這試驗(yàn)對(duì)孕婦有小孩特別不宜使用，盡管它的優(yōu)點(diǎn)類同于¹³CO₂呼氣試驗(yàn)，即使對(duì)成人亦應(yīng)慎重使用。

3.2　15N-尿素排出試驗(yàn)

這一試驗(yàn)是我國(guó)吳繼宗等人利用類似的原理在國(guó)際上首創(chuàng)的，其方法是用¹⁵N標(biāo)記的尿素供患者口服，然后收集2h尿檢出其¹⁵N－尿氨的排出率，以判斷胃內(nèi)Hp感染程度。這一試驗(yàn)具有¹³CO₂呼氣試驗(yàn)同樣的優(yōu)點(diǎn)quanxiangyun.cn/zhuyuan/，它是無(wú)損傷性的，不需作胃鏡，亦無(wú)放射性損傷；它是無(wú)損傷性的，不需作胃鏡，亦無(wú)放射性損傷；它的敏感性特異性高，是定量的，且是反映整個(gè)胃的感染情況，克服了活檢標(biāo)本采樣有損傷性和分布不均的缺點(diǎn)，采樣比呼氣試驗(yàn)方便，測(cè)定的準(zhǔn)確性較高，缺點(diǎn)與¹³C－呼氣試驗(yàn)相同，檢測(cè)需用質(zhì)譜儀，檢測(cè)費(fèi)用較高，但是¹⁵N－尿素比¹³C－尿素要便宜得多，且有國(guó)產(chǎn)的，因此在必要時(shí)仍然是一種可以推廣使用的方法。例如：孕婦、小孩、老年人需要診斷Hp感染但不宜作胃鏡或是¹⁴C－呼氣試驗(yàn)檢查時(shí)；為了鑒定一種抗Hp藥物究竟有沒(méi)有體內(nèi)療效及沒(méi)有胃病主訴但需要發(fā)解有無(wú)Hp感染的人等等。近年來(lái)對(duì)功能性胃消化不良究竟是否與Hp感染有關(guān)，臨床上爭(zhēng)論不休，可能¹⁵N－尿氨排出試驗(yàn)是研究這一問(wèn)題的最好方法之一¹²。由于¹⁵N－尿氨排出試驗(yàn)是一種尿素在胃內(nèi)分解后，¹⁵N經(jīng)吸收通過(guò)腎臟由尿排出的試驗(yàn)，因此有嚴(yán)重肝腎功能損害者不宜使用。

4　血清學(xué)方法

Hp相關(guān)的慢性胃炎能引起對(duì)Hp的局部和全身性免疫反應(yīng)。這一反應(yīng)構(gòu)成了特異性地鑒定胃活檢標(biāo)本中的Hp（例如用單克隆抗體)和企圖用血清學(xué)方法診斷和評(píng)價(jià)療效的努力的基礎(chǔ)。雖然對(duì)研究了解Hp感染體液免疫反應(yīng)有了一些進(jìn)展，但對(duì)后者目標(biāo)的成功是有限的。

胃活檢中Hp陽(yáng)性的病人中，IgG和IgA對(duì)Hp整菌混合抗原的抗體滴度高于活檢陰性病人，IgM抗體在Hp陽(yáng)性和陰性個(gè)體間無(wú)明顯差別。大量工作表明，ELISA比細(xì)菌凝集反應(yīng)或補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)檢測(cè)Hp抗體更敏感。因此，IgG和IgA　ELISA是目前通常采用的方法。同時(shí)測(cè)定兩種免疫球蛋白能提高這一方法的敏銳性�；�于整菌混合抗原的ELISA與含有空腸彎曲菌的抗原有交叉反應(yīng)，因此許多學(xué)者都在積極努力用各種方法提取Hp的高特異性的抗原。有報(bào)告認(rèn)為，用Hp的尿素酶作抗原可使ELISA的敏感性和特異性分別達(dá)到98.7％和100％。Pronovost等用Hp外膜蛋白提取的種特異性抗原，設(shè)計(jì)了一種快速的滲濾膜酶免疫試驗(yàn)取代了ELISA試驗(yàn)，其敏感性為94％，特異性＞99％，這種類型的試劑國(guó)內(nèi)亦已有人在研制。在未治療的Hp患者中，抗體水平提高的，且可隨著時(shí)間的推移而逐步升高，Hp根除后，抗體水平可逐漸下降，但是，需要長(zhǎng)期隨訪，才能最后斷定下降的程度，為此，抗體滴度不適于用作監(jiān)測(cè)抗Hp療效的手段。唾液是一種體液，也曾用于Hp抗體的檢測(cè)，收集唾液是無(wú)侵襲性的，相當(dāng)方便適用于大多數(shù)病人，包括兒童，雖然唾液抗體的出現(xiàn)與血清中的測(cè)量大致相當(dāng)，但是有關(guān)唾液試驗(yàn)的方法學(xué)問(wèn)題以及采集無(wú)污染唾液的困難程度阻礙了唾液抗滴度作為一種診斷試驗(yàn)在臨床上的廣泛采用。

由于Hp感染的自然清除是罕見(jiàn)的，因此一般可以假定血清學(xué)試驗(yàn)陽(yáng)性表明現(xiàn)時(shí)有感染，除非已采用了抗Hp療法，血清學(xué)方法簡(jiǎn)便，成本較低，患者對(duì)采血的這一點(diǎn)侵襲性遠(yuǎn)比做胃鏡檢查樂(lè)意接收，因此在一定條件下仍有它的使用價(jià)值。

5　分子生物學(xué)方法

多聚酶鏈反應(yīng)　多聚酶鏈反應(yīng)（Poly-merasechain reaction，PCR)實(shí)際上是一種核酸片段體外擴(kuò)增試驗(yàn)。做這一試驗(yàn)的先決條件是首先必須弄清楚某一基因的核苷酸序列然后人工合成其中兩個(gè)特異性處段（其長(zhǎng)度以15—30個(gè)堿基為宜，不宜過(guò)短或過(guò)長(zhǎng))作為引物，在PCR儀中經(jīng)過(guò)30—50個(gè)溫度循環(huán)擴(kuò)增其核酸片段，使其呈幾何級(jí)數(shù)長(zhǎng)，然后取其產(chǎn)生或其酶切片段在瓊脂糖上跑電泳，即可判斷所得產(chǎn)物是否即企望的基因產(chǎn)物。目前亦已可用這一反應(yīng)來(lái)測(cè)知標(biāo)本中有無(wú)Hp的存在，甚至還可進(jìn)一步用核苷酸序列分析或特異性探針加以鑒定。關(guān)于Hp的PCR根據(jù)所選引物的不同已經(jīng)有許多種，已知的這些引特主要來(lái)自Hp的尿素酶基因（UreA，UreB，UreC，UreD)，16SrRNA和編碼26KDa蛋白質(zhì)的核苷酸序列，縱觀不同學(xué)者所選用的引物，現(xiàn)在都能特異地以Hp有關(guān)基因作模板，擴(kuò)增出部分核苷酸序列，而不引導(dǎo)擴(kuò)增了其他細(xì)菌核苷酸序列。因此對(duì)Hp檢測(cè)的特異性和敏感性均較高，目前已開(kāi)始用于各種臨床標(biāo)本（活檢、胃液、牙菌斑等)的檢測(cè)和某些動(dòng)物胃標(biāo)本的檢測(cè)，有人還用PCR擴(kuò)增后所得的DNA產(chǎn)物，以核酸內(nèi)切作指紋圖譜分析，用于Hp的流行病學(xué)研究。隨著PCR的發(fā)展，Williums等在這一基礎(chǔ)上又發(fā)展出了RAPD（Randmoamplified polymorphic DNA)技術(shù)或稱AP(arbitrary primer)—PCR。它的原理是采用隨機(jī)選出的單一核苷酸鏈為引物以靶DNA模板在多個(gè)部位引導(dǎo)擴(kuò)增DNA。經(jīng)過(guò)RADP技術(shù)處理的結(jié)果可顯示出不同Hp株的特異性。因此亦有人把此方法用于Hp的流行病學(xué)研究上。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，PCR技術(shù)的應(yīng)用在Hp的研究中很有前途，它反應(yīng)快，標(biāo)本運(yùn)輸條件要求不高，甚至可以郵寄，可是PCR的高敏感性也可能是它致命的弱點(diǎn)：使用試劑的濃度，操作的溫度，過(guò)度的擴(kuò)增，極少DNA的污染等都可導(dǎo)致假陽(yáng)性，因此嚴(yán)格控制件，合理選擇DNA擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)，謹(jǐn)防污染仔細(xì)設(shè)置對(duì)照等都是不可忽視的因素。

總之，Hp感染有許多方法檢查，最簡(jiǎn)便的，成本最低廉的，僅有極小侵襲性的是血清學(xué)方法�？墒牵�血清學(xué)陽(yáng)性只能說(shuō)曾感染過(guò)或現(xiàn)在正在感染，¹³C(20)和¹⁵N(21)同位素示蹤方法是完全無(wú)損傷性的，且能檢測(cè)即時(shí)使整個(gè)胃的感染情況。因此是比較理想的�？墒怯捎谑茉O(shè)備限制，費(fèi)用較貴難于普遍推廣，¹⁴C同位素示蹤法雖然大醫(yī)院有條件可做，價(jià)格比¹³C，¹⁵N便宜，但有放射性損害，內(nèi)窺鏡檢查取活檢標(biāo)本是侵襲性的，可作微生物學(xué)的直接檢查，同時(shí)可以觀察組織學(xué)變化，亦可為分子生物學(xué)檢查提供材料，若欲簡(jiǎn)單一些，可以只做快速尿素酶試驗(yàn)，最后，從活檢標(biāo)本分離培養(yǎng)Hp，雖然因驗(yàn)一些，但對(duì)選擇合適的抗Hp治療方案是必備條件。