甲、鎢酸沉淀法
1 試劑
1.110%鎢酸鈉溶液
取鎢酸鈉10g,加蒸餾水使溶解成100ml。
1.2 0.33mol/L硫酸溶液
量取化學(xué)純硫酸1.86ml,緩緩注入適量的蒸餾水中,待冷加水稀釋至100ml。
1.30.145mol/L氯化鈉溶液
取氯化鈉9g,加蒸餾水使溶解成1000ml。
2 操作
2.1 鎢酸除蛋白質(zhì)
精確量取樣品2ml加蒸餾水14ml,加10%鎢酸鈉2ml,0.33mol/L硫酸2ml,搖勻,靜置30分鐘過濾。
2.2 精確量取樣品1ml,用0.145mol/L氯化鈉溶液準(zhǔn)確稀釋至每ml含氮量1mg左右。
2.3 精確量取稀釋液1ml及除蛋白質(zhì)濾液5ml,分別移入凱氏定氮瓶中,用半微量定氮法測定樣品的總氮及非蛋白氮含量。
3 計算
樣品總氮含量(mg/ml)=(樣品滴定數(shù)-空白滴定數(shù))×標(biāo)準(zhǔn)鹽酸mol/L×14×稀釋倍數(shù)
樣品非蛋白氮含量(mg/ml)=(樣品滴定數(shù)-空白滴定數(shù))×標(biāo)準(zhǔn)鹽酸mol/L×14×12
樣品蛋白質(zhì)含量(g/ml)=(總氮-非蛋白氮)×6.25×1/10
附注
1.樣品蛋白質(zhì)含量如超過10%(g/ml),除蛋白質(zhì)時應(yīng)適當(dāng)加大樣品稀釋倍數(shù),10%鎢酸鈉及0.33mol/L硫酸用量相應(yīng)地按比例增加,使溶液鎢酸濃度仍保持1%。
2.總氮與非蛋白氮可用同一空白。
乙、三氯醋酸沉淀法
1 2%三氯醋酸溶液
取三氯醋酸12g,加蒸餾水溶解至100ml。
2 操作
精確量取一定體積的樣品(含蛋白質(zhì)6~12mg左右,于10ml尖底離心管中,加等體積的12%三氯醋酸混勻,放置半小時后3000r/min離心30分鐘,傾凈上清,沉淀用蒸餾水約3ml(分?jǐn)?shù)次)洗入凱氏燒瓶,按半數(shù)量定氮法測定氮含量。
3 計算
(樣品滴定數(shù)– 空白滴定數(shù))×標(biāo)準(zhǔn)鹽酸mol/L×14
樣品蛋白質(zhì)含量(mg/ml)──────────────────────×6.25
樣品ml數(shù)
丙、微量法(Lowry法)
1.試劑
1.1 4%碳酸鈉溶液
取4g碳酸鈉,加蒸餾水溶解成100ml。
1.2 0.2mol/L氫氧化鈉溶液
取0.8g氫氧化鈉加蒸餾水,溶解成100ml。
1.3 0.04mol/L硫酸銅溶液
取1gCuSO4·5H2O加蒸餾水溶解成100ml。
1.42%酒石酸鉀(或0.1mol/L酒石酸鈉)
取2g酒石酸鉀(或酒石酸鈉),加蒸餾水溶解成100ml。
1.5 堿性銅液
臨用前取試劑1.1和1.2各25ml,試劑1.3和1.3各0.5ml混勻配制而成。
1.6 酚試劑
稱取100g鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O),25g鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)quanxiangyun.cn/Article/,置1500ml燒瓶中,加入700ml蒸餾水,50ml 85%磷酸及100ml濃鹽酸,上聯(lián)回流管(使用木塞或錫紙包裹的橡皮塞)微沸加流10小時,取下回流管,加入150g硫酸鋰,50ml蒸餾水,幾滴溴液,煮沸約15分鐘,驅(qū)除過量的溴。冷卻,加蒸餾水稀釋至1000ml,過濾,為酚試劑貯備液。
酚試劑貯備液經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉液滴定,測定酸濃度,而后用蒸餾水稀釋至相當(dāng)1mol/L鹽酸濃度,即為酚試劑。
1.7 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液
取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(由檢定所統(tǒng)一標(biāo)定發(fā)給),準(zhǔn)確稀釋至1mg/ml(含0.02%NaN3),為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)貯備液。精確量取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)貯備液2.5ml于25ml容量瓶中,用含0.02%NaN3的蒸餾水稀釋至刻度,為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(100μg/ml)。
2 操作
2.1 樣品
精確量取一定體積樣品(含蛋白質(zhì)50μg左右)于試管中,加5ml堿性銅液,混勻,于室溫放置10分鐘,快速加入0.5ml酚試劑,搖勻,于室溫放置30分鐘,用650nm波長或紅色濾光片比色(呈色后,如發(fā)現(xiàn)混濁,經(jīng)3000r/min離心15分鐘后再比色)。
2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線
精確量取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(100μg/ml)0、0.2、0.4、0quanxiangyun.cn/job/.6、0.8、1.0ml,分別置于試管中,加蒸餾水補(bǔ)至1ml,其余操作同樣品,可得一標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3 計算
從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出樣品相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液之ml數(shù)A;
A×0.01%
樣品蛋白質(zhì)含量(g/ml)= ────────
樣品ml數(shù)
附注
檢測A群腦膜炎多糖抗原半成品原液可取1ml(含抗原3~10mg)。