抗原免疫動(dòng)物產(chǎn)生的抗體是血清γ-球蛋白的一部分。抗體的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)與γ-球蛋白相近似。γ-球蛋白是一組結(jié)構(gòu)相似,但又有差異的蛋白質(zhì),通稱(chēng)為免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig),按其結(jié)構(gòu)和免疫化學(xué)性質(zhì)的差異,又可分為五類(lèi),分別稱(chēng)為IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。載脂蛋白抗體以IgG最為穩(wěn)定。因載脂蛋白的體液中含量不同以及分離純化的難易的差別,可分別采用多克隆抗體制備法和單克隆抗體制備法。
1.多克隆抗體的制備
(1)抗原
目前所知的載脂蛋白進(jìn)入異種機(jī)體后,能致敏淋巴細(xì)胞,與抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合復(fù)合物,即具備有抗原性?乖园庖咴院涂乖禺愋詢煞矫娴暮x。載脂蛋白因具備抗原特異性和免疫原性,因此可稱(chēng)為完全抗原,大多數(shù)動(dòng)物的免疫系統(tǒng)是非常敏感的,用于免疫的抗原僅需要極微量?乖瓚(yīng)該是純化品,該純品在12.5%的PAG電泳后,僅出現(xiàn)一條區(qū)帶,即認(rèn)為可用于免疫抗原純品。
(2)免疫
動(dòng)物的選擇:通常選擇壯年、成熟且健壯的豚鼠、雞、兔、山羊、quanxiangyun.cn/job/綿羊、馬等動(dòng)物。一般多先用大白兔。作為批量生產(chǎn),以采用山羊或綿羊,若需量再多,可考慮用馬作為免疫動(dòng)物。因動(dòng)物個(gè)體差異的關(guān)系,即使是用一種抗原去免疫多個(gè)白兔,所得抗血清特異性會(huì)有很大的差別。因此,為了得到比較一致的抗血清,常用能產(chǎn)生大量抗血清的羊或馬為免疫動(dòng)物。
佐劑:佐劑是指與抗原混合注入機(jī)體后,能增加抗原的免疫性或者能改變免疫反應(yīng)類(lèi)型的一種物質(zhì)。人們公認(rèn)的佐劑是福氏佐劑(Freund’adguvant),具有明顯的免疫剌激作用。福氏佐劑又可分為兩種,即不完全佐劑和完全佐劑,屬于一種油包水的乳劑,由羊毛脂或甘露糖醇單油酸酯(arlacela)為乳劑。油包水乳化劑有助于促進(jìn)免疫反應(yīng)的進(jìn)行,還可起部分保護(hù)不穩(wěn)定抗原的作用,使抗原在體內(nèi)的吸收期延長(zhǎng),從而減少加強(qiáng)注射的次數(shù)。在不完全佐劑內(nèi)加入殺死的分枝桿菌(如結(jié)核桿菌或卡介苗)制備成完全佐劑。分枝桿菌能增加局部淋巴結(jié)的炎癥反應(yīng),擴(kuò)大免疫原性,從而促進(jìn)最終高親和力抗體的形成。佐劑有成品購(gòu)買(mǎi),也可自行制備。佐劑制備方法是,取石蠟油6份、羊毛脂4份,再加5份不含抗原的抗原緩沖液(含0.1%SDS),混勻,滅菌,分裝于小玻璃瓶中,0~8℃保存,此為不完全佐劑。在不完全佐劑中加入卡介苗(3~5mg/0.5ml)即為完全佐劑,均貯存于0~8℃。臨用時(shí),取完全佐劑3份加入含抗原的緩沖液1份,混勻,振搖或研磨,使其成為乳化狀態(tài),因?yàn)楹琒DS很易促使其乳化成油包水抗原乳化復(fù)合物,注射入動(dòng)物體內(nèi)時(shí)一定要保持乳化狀態(tài)?乖昧恳暱乖肿恿坎煌懊庖咴约懊庖邉(dòng)物不同而有一定差異,無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)和固定模式。一般是每兔(約2kg重)或每羊(約20kg重)第1次注射抗原1mg,以后逐次增加抗原量,最多每次不超過(guò)3mg。
免疫途徑及方法:免疫部位可分別選用皮內(nèi)、皮下或淋巴結(jié)。第1次免疫采用皮內(nèi)結(jié)合皮下多點(diǎn)注射,常注射在背部或腿部。許多作者介紹在后足蹠皮下或皮內(nèi)注射,因?yàn)樗淖懵涞氐年P(guān)系很易造成感染,使第1次免疫失效,并使動(dòng)物行走不便,造成傷害。整個(gè)免疫過(guò)程以2~3個(gè)月為宜。一般是第1次免疫后的3~4周再進(jìn)行第2次免疫,不完全佐劑為乳化劑。2周后加強(qiáng)1次(不完全佐劑),2周后又加強(qiáng)1次(不完全佐劑或完全佐劑),1周后再免疫1次。待最后一次免疫后的7~10天,取靜脈血測(cè)試抗體效價(jià)(試血),效價(jià)達(dá)到要求后即可一次性放血,采用頸動(dòng)脈放血,得抗血清。筆者采用此法先后免疫成功ApoAⅠ、AⅡ、B100和E的抗血清。
(3)抗血清的保存
免疫成功的動(dòng)物放血過(guò)程,所有用具均嚴(yán)格消毒,并按無(wú)菌操作方式進(jìn)行放血?寡宓姆栏瘎┮0.05%疊氮鈉為宜;也可采用加入20%~30%無(wú)菌甘油保存的方法。若時(shí)間較長(zhǎng),不用可采用-20℃低溫保存。一般在0~8℃保存1年,抗體效價(jià)幾乎無(wú)改變,保存2年,其效價(jià)稍有降低。抗體切忌反復(fù)凍融,否則抗體效價(jià)很快降低,以頸動(dòng)脈一次性放血為宜。
2.單克降抗體的制備
單克隆抗體是一種高度特異性的抗體。單克隆抗體與多克隆抗體有一定的差別?贵w含量比較,單克隆抗體濃度高,腹水中可達(dá)0.5~10mg/ml,而多克隆僅0.1~1.0mg/ml;結(jié)合特性,單克隆抗體僅與單個(gè)抗原決定簇結(jié)合,特異性和親和力高,多克隆抗體可與所有抗原決定簇結(jié)合,特異性和親和力比較差;含免疫球蛋白類(lèi)型,單克隆抗體僅一種亞類(lèi),多克隆抗體為所有種類(lèi)和亞類(lèi)。單克隆抗體在腹水中含量較高,可以人工培養(yǎng),專(zhuān)一性強(qiáng)等特性是多克隆抗體無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)。
(1)單克隆抗體產(chǎn)生機(jī)理
單克隆抗體制備過(guò)程中需要兩種細(xì)胞和即骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞。骨髓瘤細(xì)胞是一種惡變細(xì)胞,在體外有無(wú)限的增殖能力,并能分泌很多化學(xué)結(jié)構(gòu)均一的免疫球蛋白,但特異性很差,當(dāng)它與不同性質(zhì)的動(dòng)物脾細(xì)胞融合時(shí),可形成雜交瘤細(xì)胞株。該細(xì)胞株在HAT培養(yǎng)基(內(nèi)含次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶)中生長(zhǎng)良好,而骨髓瘤細(xì)胞則在HAT培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)。因?yàn)棰偃狈Υ吸S嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶,不能利用次黃嘌呤合成嘌呤;②氨基喋呤可阻止細(xì)胞內(nèi)嘌噙和胸腺嘧啶的合成。經(jīng)免疫的動(dòng)力脾細(xì)胞,不能在體外增殖,但是能產(chǎn)生相應(yīng)的特異抗體,可以與骨髓瘤細(xì)胞融合,并形成可分泌單克隆抗體的細(xì)胞株。
操作過(guò)程,一般是先把骨髓瘤細(xì)胞和經(jīng)免疫的脾細(xì)胞置在聚乙二醇(PEG)中進(jìn)行融合,然后在HAT培養(yǎng)液中選擇培養(yǎng),由此得到雜交瘤細(xì)胞,采用有限稀釋法,即能把產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株篩選出來(lái)。該細(xì)胞再經(jīng)人工培養(yǎng),或注射到小鼠體內(nèi)等亞克隆方法,即可得到單克隆抗quanxiangyun.cn/Article/體。
(2)操作:以ApoAⅠ為例。①免疫小鼠:取ApoAⅠ500μg注射入小鼠腹腔內(nèi),抗原以1:1的比例溶于完全福氏佐劑中乳化。每2~3周追加一次1:1不完全福氏佐劑抗原混合物,共3次。一般1次接種5~10只小鼠。從每只小鼠尾靜脈或眼眶取血,采用ELISA方法或單向免疫擴(kuò)散法鑒定抗體效價(jià),用作鑒定的鼠血清至少按1:2000稀釋。在取出小鼠脾臟之前3天應(yīng)該再靜脈注射一次抗原以提高其效價(jià);②培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞:取HGPRT-骨髓瘤細(xì)胞,經(jīng)HAT培養(yǎng)液培養(yǎng),并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞(細(xì)胞死亡數(shù)<5%)供融合使用;③制備脾細(xì)胞:將接種免疫成功的小鼠脾臟取出(無(wú)菌操作),放入裝有5ml冷水的不含血清DMEM(高葡萄糖)液中,勻漿,直至成為單細(xì)胞懸液(約108細(xì)胞),將脾細(xì)胞移入到一個(gè)50ml有蓋管內(nèi),冰水中靜置5分鐘,待碎片沉淀后,將上清液移出。離心,NH4Cl緩沖液溶解脾細(xì)胞中的紅細(xì)胞,得到脾細(xì)胞懸液(無(wú)紅細(xì)胞);④細(xì)胞融合(雜交)增殖:取瘤細(xì)胞(107)與脾細(xì)胞(6×107)混合,再洗1次,制備雙份,分別用40%PEG1000(pH8.0)進(jìn)行融合,離心沉淀,于沉淀細(xì)胞中加RPM1-1604完全培養(yǎng)液稀釋。取此稀釋液0.5ml分別加到含腹腔細(xì)胞(HGPRT-小鼠)的24孔板的每一孔穴中,置于37℃溫箱中,次日吸出0.5ml上清液,加入HAT溶液0.5ml。如此連續(xù)操作兩天,以后每隔2~3天重復(fù)1次,半月后改換HT培養(yǎng)液,再過(guò)半月后,改用RPM1-1604完全培養(yǎng)液,均處于37℃環(huán)境;⑤單克隆抗體細(xì)胞株篩選;當(dāng)雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)滿孔穴的1/3時(shí),即可對(duì)培養(yǎng)液中的抗體檢測(cè),連續(xù)2次呈陽(yáng)性孔穴,要立即克隆到預(yù)先加腹腔細(xì)胞(104/孔)的96孔板中,每孔含有一個(gè)雜交瘤細(xì)胞,一般經(jīng)3~4天后克隆細(xì)胞開(kāi)始增殖。接著再挑出陽(yáng)性孔穴進(jìn)行克隆,這樣得到的上清液即為單克隆抗體;⑥雜交瘤細(xì)胞腹水單克隆抗體的制備:取0.5ml Pristane(2,6,10,14-四甲基十五烷)液注射入HGPRT-小鼠腹腔內(nèi),7~15天后,取0.5×106~1.0×106雜交瘤細(xì)胞以同一途徑進(jìn)行注射,15~30天后可以收集腹水5~10ml,抗體效價(jià)顯著增高;單克隆抗體制備過(guò)程如圖18-1所示;⑦細(xì)胞株的保存:于保存管中加入0.5~1.0ml保存液(含10%二甲基亞砜的小牛血清液)106雜交瘤細(xì)胞株,置聚乙烯塑料盒。-40~-80℃過(guò)夜,爾后移至液氮罐保存。
圖 18-1 單克隆抗體的制備(源自:Goding JW.1987)
(3)抗體的檢測(cè)
抗體檢測(cè)可分別采用免疫火箭電泳法、單向擴(kuò)散法、免疫電泳法、ELISA法、免疫透射比濁法和放射免疫沉淀法。