網(wǎng)站首頁(yè)
醫(yī)師
藥師
護(hù)士
衛(wèi)生資格
高級(jí)職稱(chēng)
住院醫(yī)師
畜牧獸醫(yī)
醫(yī)學(xué)考研
醫(yī)學(xué)論文
醫(yī)學(xué)會(huì)議
考試寶典
網(wǎng)校
論壇
招聘
最新更新
網(wǎng)站地圖
您現(xiàn)在的位置: 醫(yī)學(xué)全在線(xiàn) > 藥學(xué)理論 > 中國(guó)藥品專(zhuān)利文獻(xiàn) > 正文:人甲狀旁腺激素與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品專(zhuān)利檢索:專(zhuān)利號(hào)/專(zhuān)利人/發(fā)明人
    

人甲狀旁腺激素與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品

公開(kāi)(公告)號(hào) CN101063125A  
公開(kāi)(公告)日 2007.10.31  
申請(qǐng)(專(zhuān)利)號(hào) CN200710020892.1  
申請(qǐng)日期 2007.04.17  
專(zhuān)利名稱(chēng) 人甲狀旁腺激素與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品  
主分類(lèi)號(hào) C12N15/09(2006.01)I  
分類(lèi)號(hào) C12N15/09(2006.01)I;C12N15/62(2006.01)I;C07K19/00(2006.01)I;C12N1/19(2006.01)I  
分案原申請(qǐng)?zhí)?  
優(yōu)先權(quán)  
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人 江南大學(xué)  
發(fā)明(設(shè)計(jì))人 沈 微;金 堅(jiān);諸葛健;王 俊;張蓮芬  
地址 214122江蘇省無(wú)錫市蠡湖大道1800號(hào)  
頒證日  
國(guó)際申請(qǐng)  
進(jìn)入國(guó)家日期  
專(zhuān)利代理機(jī)構(gòu) 無(wú)錫市大為專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所  
代理人 時(shí)旭丹;劉品超  
國(guó)省代碼 江蘇;32  
主權(quán)項(xiàng) 人甲狀旁腺激素與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法,其特征是從新鮮人甲狀旁腺組織中分離單核甲狀旁腺細(xì)胞,刺激培養(yǎng),提取RNA;通過(guò)RT-PCR反轉(zhuǎn)錄得到PTHcDNA;通過(guò)PCR從人胎肝cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增獲得HSAcDNA;利用重疊PCR技術(shù),連接HSAcDNA和PTHcDNA,中間不加入任何連接肽,得到的PTH-HAScDNA融合基因插入到克隆載體,PTH-HAScDNA融合基因在宿主系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá),PTH-HAScDNA融合基因被整合到宿主的染色體中; (1)PTHcDNA的克。 以RT-PCR反轉(zhuǎn)錄得到的PTHcDNA第一鏈為模板,通過(guò)PCR擴(kuò)增出PTHcDNA,所用的引物如下: p1:5’CGGAATTCATGACCCCCCTGGGCCCTGC-3’ p2:5’CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGC-3’ PCR方法如下:50μl的反應(yīng)體系中加入:10μmol/L的p1和p2的引物各1.5μl,2mmol/L的dNTP5μl,10×pfuBuffer5μl,5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl,PTHcDNA第一鏈1μg,加雙蒸水補(bǔ)齊50μl,PCR條件為:95℃變性10分鐘,94℃變性1分鐘,65℃退火1分鐘,72℃延伸90秒,循環(huán)35次; 通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物,在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶,用PCR片段膠回收試劑盒純化出0.27kb的目標(biāo)片段,純化好的目標(biāo)片段和載體pBluescriptIIKS(+)分別經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切;瓊脂糖凝膠電泳純化,用PCR片段膠回收試劑盒回收,用T4連接酶連接兩酶切后純化好的片段;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化物涂布于含有100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板,37℃培養(yǎng)過(guò)夜;隨機(jī)挑取5個(gè)單菌落,接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過(guò)夜,提取質(zhì)粒;通過(guò)PCR,及EcoRI和HindIII雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽(yáng)性克隆,并對(duì)重組質(zhì)粒EcoRI和HindIII雙酶切位點(diǎn)間區(qū)域進(jìn)行DNA測(cè)序;陽(yáng)性重組子保存在含有15%甘油的LB中,凍存于-80℃;重組質(zhì)粒命名為pBlue-PTH,陽(yáng)性重組子命名為DH5α/pBlue-PTH; (2)HSAcDNA的克。 利用PCR從人胎肝cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出HSAcDNA,所用的引物為: PH1:5’AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’ PH2:5’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’ PCR方法如下:50μl的反應(yīng)體系中加入:10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl,2mmol/L的dNTP5μl,10×pfuBuffer1μl,5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl,人胎肝cDNA文庫(kù)1μg,加雙蒸水補(bǔ)齊50μl;PCR條件為:95℃變性5分鐘,94℃變性1分鐘,60℃退火1分鐘,72℃延伸90秒,循環(huán)30次; 通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物,在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶,用PCR片段膠回收試劑盒純化出1.8kb的目標(biāo)片段,純化好的目標(biāo)片段和載體pBluescriptIIKS(+)分別經(jīng)SalI和HindIII雙酶切;瓊脂糖凝膠電泳純化,用PCR片段膠回收試劑盒回收,用T4連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板,37℃培養(yǎng)過(guò)夜;挑取白色菌落,接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過(guò)夜,提取質(zhì)粒;通過(guò)PCR,及SalI和HindIII雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽(yáng)性克隆,并對(duì)重組質(zhì)粒SalI和HindIII雙酶切位點(diǎn)間區(qū)域進(jìn)行DNA測(cè)序;陽(yáng)性重組子保存在含有20%甘油的LB中,凍存于-80℃;重組質(zhì)粒命名為pBlue-HSA,陽(yáng)性重組子命名為DH5α/pBlue-HAS; (3)PTHcDNA和HSAcDNA融合基因的克隆: HSAcDNA的PCR擴(kuò)增,所用引物如下: P1:5’-CGGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCG-3’ P2:5’-CAGGGGGGTGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAA-3’ PCR方法如下:50μl的反應(yīng)體系中加入:10μmol/L的引物P1和P2各1.5μl,2mmol/L的dNTP5μl,10×pfuBuffer5μl,5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl,pBlue-HSA1μg,加雙蒸水補(bǔ)齊50μl;PCR條件為:95℃變性5分鐘,65℃退火1分鐘,72℃延伸4分鐘,94℃變性1分鐘,循環(huán)30次; PTHcDNA的PCR擴(kuò)增,所用引物如下: P3:5’-CTGCCTTAGGCACCCCCCTGGGCCCTG-3’ P4:5’-CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGAAC-3’ PCR方法如下:50μl的反應(yīng)體系中加入:10μmol/L的P3和P4的引物各1.5μl,2mmol/L的dNTP5μl,10×pfuBuffer5μl,5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl,pBlue-PTH1μg,加雙蒸水補(bǔ)齊50μl;PCR條件為:95℃變性5分鐘,66.5℃退火1分鐘,72℃延伸90秒,94℃變性1分鐘,循環(huán)30次; 利用重疊PCR融合PTHcDNA和HSAcDNA: 將PTH的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和HSA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別稀釋10倍,再以4∶6體積比混合后作為模板,于50μl的反應(yīng)體系中加入:2mmol/L的dNTP5μl,10×pfuBuffer5μl,5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl,混合好的模板1μl,加雙蒸水補(bǔ)齊50μl;PCR條件為:95℃變性5分鐘,60℃退火1分鐘,72℃延伸4分鐘,94℃變性1分鐘,循環(huán)30次; 通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物,在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶,用P  
摘要 人甲狀旁腺激素(PTH)與人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品,屬于長(zhǎng)效重組融合蛋白藥物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用重疊PCR技術(shù),將HAS cDNA和PTH cDNA進(jìn)行拼接,中間不加入任何連接肽,得到的PTH-HSA cDNA融合基因被整合到宿主的染色體中,在宿主系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。本發(fā)明的融合蛋白包括與人血清白蛋白至少85%序列同源的第一區(qū)和與人甲狀旁腺激素至少85%序列同源的第二區(qū)。該融合蛋白可以在不改變?nèi)诤系鞍滋匦缘那疤嵯拢M(jìn)行個(gè)別氨基酸殘基的取代、缺失或加入。本發(fā)明的融合蛋白在保持了人甲狀旁腺激素生理特性的基礎(chǔ)上,延長(zhǎng)其在體內(nèi)的半衰期,改善其溶解度,在藥學(xué)領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。  
國(guó)際公布  
...
評(píng)論加載中...
網(wǎng) 名: (必填項(xiàng))
評(píng)論內(nèi)容:
關(guān)于我們 - 聯(lián)系我們 -版權(quán)申明 -誠(chéng)聘英才 - 網(wǎng)站地圖 - 醫(yī)學(xué)論壇 - 醫(yī)學(xué)博客 - 網(wǎng)絡(luò)課程 - 幫助
醫(yī)學(xué)全在線(xiàn) 版權(quán)所有© CopyRight 2006-2046, MED126.COM, All Rights Reserved
浙ICP備12017320號(hào)-1
百度大聯(lián)盟認(rèn)證綠色會(huì)員可信網(wǎng)站 中網(wǎng)驗(yàn)證