公開(kāi)(公告)號(hào)
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CN101063124A
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公開(kāi)(公告)日
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2007.10.31
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申請(qǐng)(專利)號(hào)
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CN200710020891.7
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申請(qǐng)日期
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2007.04.17
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專利名稱
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人白介素-11與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品
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主分類號(hào)
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C12N15/09(2006.01)I
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分類號(hào)
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C12N15/09(2006.01)I;C12N15/62(2006.01)I;C07K19/00(2006.01)I;C12N1/19(2006.01)I
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分案原申請(qǐng)?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(qǐng)(專利權(quán))人
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江南大學(xué)
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發(fā)明(設(shè)計(jì))人
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李華鐘;金 堅(jiān);段作營(yíng);孫慧碧;張蓮芬
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地址
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214122江蘇省無(wú)錫市蠡湖大道1800號(hào)
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頒證日
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國(guó)際申請(qǐng)
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進(jìn)入國(guó)家日期
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專利代理機(jī)構(gòu)
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無(wú)錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所
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代理人
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時(shí)旭丹;劉品超
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國(guó)省代碼
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江蘇;32
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主權(quán)項(xiàng)
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人白介素-11與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法,其特征是從人骨髓基質(zhì)細(xì)胞中分離細(xì)胞,提取RNA,通過(guò)RT-PCR反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增得到IL-11cDNA;通過(guò)PCR從人胎肝cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增獲得HSAcDNA;利用重疊PCR技術(shù),連接IL-11cDNA和HSAcDNA,中間不加入任何連接肽,得到的HSA-IL-11cDNA融合基因插入到克隆載體;HSA-IL-11cDNA融合基因在宿主系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá),HSA-IL-11cDNA融合基因被整合到宿主的染色體中; (1)IL-11-cDNA克隆 以RT-PCR反轉(zhuǎn)錄得到的IL-11cDNA第一鏈為模板,通過(guò)PCR擴(kuò)增出IL-11cDNA,所用的引物如下: P1:5’-GTCAAGCTGCCTTAGGCTTACCTGGGCCACCACCTGGCCC-3’ P2:5’-GCGGCCGCTCACAGCCGAGTCTTCAGCAGCAG-3’ PCR方法如下:50μl的反應(yīng)體系中加入:10μmol/L的P1和P2的引物各1.5μl,2mmol/L的dNTP5μl,10×pfuBuffer5μl,5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl,IL-11cDNA第一鏈1μg,加雙蒸水補(bǔ)齊50μl,PCR條件為:94℃變性5分鐘,55℃退火30秒,72℃延伸45秒,循環(huán)28次,最后72℃延伸5分鐘; 通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物,在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶,用PCR片段膠回收試劑盒純化出0.5kb的目標(biāo)片段,對(duì)目標(biāo)片段產(chǎn)物進(jìn)行T-A克隆到pMD19T-Vector中,重組質(zhì)粒命名為pMD-IL-11; (2)HSA-cDNA的克。 利用PCR從人胎肝cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出HSAcDNA,所用的引物為: PH1:5’-AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’ PH2:5’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’ PCR方法如下:50μl的反應(yīng)體系中加入:10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl,2mmol/L的dNTP5μl,10×pfuBuffer1μl,5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl,人胎肝cDNA文庫(kù)1μg,加雙蒸水補(bǔ)齊50μl;PCR條件為:95℃變性5分鐘,94℃變性1分鐘,60℃退火1分鐘,72℃延伸90秒,循環(huán)30次; 通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物,在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶,用PCR片段膠回收試劑盒純化出1.8kb的目標(biāo)片段,純化好的目標(biāo)片段和載體pBluescriptIIKS(+)分別經(jīng)SalI和HindIII雙酶切;瓊脂糖凝膠電泳純化,用PCR片段膠回收試劑盒回收,用T4連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板,37℃培養(yǎng)過(guò)夜;挑取白色菌落,接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過(guò)夜,提取質(zhì)粒;通過(guò)PCR,及SalI和HindIII雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽(yáng)性克隆,并對(duì)重組質(zhì)粒SalI和HindIII雙酶切位點(diǎn)間區(qū)域進(jìn)行DNA測(cè)序;陽(yáng)性重組子保存在含有20%甘油的LB中,凍存于-80℃;重組質(zhì)粒命名為pBlue-HSA,陽(yáng)性重組子命名為DH5α/pBlue-HAS; (3)IL-11-cDNA的擴(kuò)增: 從pMD-IL-11質(zhì)粒中用PCR的方法擴(kuò)增,引物如下: IL-3:5’-GTCAAGCTGCCTTAGGCTTACCTGGGCCACCACCTGGCCC-3’ IL-4:5’-GCGGCCGCTCACAGCCGAGTCTTCAGCAGCAG-3’ PCR方法如下:50μl的反應(yīng)體系中加入:10μmol/L的引物IL-3和引物IL-4各2μl,2mmol/L的dNTP5μl,10×pfuBuffer1μl,5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl,pMD-IL-11質(zhì)粒1μg,加雙蒸水補(bǔ)齊50μl,PCR條件為:95℃變性5分鐘,94℃變性1分鐘,57℃退火1分鐘,72℃延伸90秒,循環(huán)30次; 通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物,在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶,用PCR片段膠回收試劑盒純化出0.5kb的目標(biāo)條帶,純化好的目標(biāo)片段備用; (4)HSAcDNA的PCR擴(kuò)增,所用的引物為: HI-1:5’-GAATTCGATGCACACAAGAGTGAGGTTG-3’ HI-2:5’-GGGCCAGGTGGTGGCCCAGGTAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3’ PCR方法如下:50μl的反應(yīng)體系中加入:10μmol/L的引物HI-1和引物HI-2各2μl,2mmol/L的dNTP5μl,10×pfuBuffer1μl,5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl,pBlue-HAS質(zhì)粒1μg,加雙蒸水補(bǔ)齊50μl;PCR條件為:95℃變性5分鐘,94℃變性1分鐘,60℃退火1分鐘,72℃延伸150秒,循環(huán)30次; 通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物,在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶,用PCR片段膠回收試劑盒純化出1.8kb的目標(biāo)條帶,純化好的目標(biāo)片段備用; (5)HSAcDNA和IL-11cDNA的連接: 利用重疊PCR融合IL-11cDNA和HSAcDNA,將IL-11cDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后和HAScDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后按照1∶1的體積比混合后作為模板,于50μl的反應(yīng)體系中加入:2mmol/L的dNTP5μl,10×TaqBuffer5μl,5U/μl的TaqDNA聚合酶0.5μl,混合好的模板1μl,加雙蒸水補(bǔ)齊45μl;PCR條件為:95℃變性5分鐘,94℃變性1分鐘,60℃退火1分鐘,72℃延伸3分鐘,循環(huán)10次后,向反應(yīng)體系中加入10μmol/L的HI-1和IL-4的引物各2.5μl,繼續(xù)做30次上述循環(huán); 通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物,在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶,用PCR片段膠回收試劑盒純化出2.3kb的目標(biāo)條帶,純化好的目標(biāo)片段HSA-IL-11cDNA,再EcoRI和NotI雙酶切純化好的片段和載體pMD19-T按照1∶7的體積比用T4連接酶連接;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1Blue感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化物涂布于含有X-gal、IPTG和10
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摘要
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人白介素-11(IL-11)與人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品,屬于長(zhǎng)效重組融合蛋白藥物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用重疊PCR技術(shù),連接IL-11cDNA和HSA cDNA,中間不加入任何連接肽,得到的HSA-IL-11cDNA融合基因被整合到宿主的染色體中,在宿主系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。本發(fā)明的融合蛋白包括與人血清白蛋白至少85%序列同源的第一區(qū)和與人白介素-11至少85%序列同源的第二區(qū),兩區(qū)直接連接,中間不加入任何連接肽,該融合蛋白可以在不改變?nèi)诤系鞍滋匦缘那疤嵯,進(jìn)行個(gè)別氨基酸殘基的取代、缺失或加入。本發(fā)明的融合蛋白在保持了人白介素-11的生理特性的基礎(chǔ)上,延長(zhǎng)其在體內(nèi)的半衰期,改善其溶解度,在藥學(xué)領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。
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國(guó)際公布
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