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公開(公告)號
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CN101037477A
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公開(公告)日
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2007.09.19
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申請(專利)號
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CN200710020034.7
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申請日期
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2007.02.08
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專利名稱
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人血清白蛋白與人粒細胞集落刺激因子的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品
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主分類號
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C07K19/00(2006.01)I
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分類號
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C07K19/00(2006.01)I;C12N15/09(2006.01)I;C12N15/62(2006.01)I;C12N1/19(2006.01)I
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分案原申請?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(專利權(quán))人
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江南大學
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發(fā)明(設計)人
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金 堅;張蓮芬;徐 鈺;許正宏;雷楗勇;竇文芳;史仲平
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地址
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214122江蘇省無錫市蠡湖大道1800號
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頒證日
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國際申請
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進入國家日期
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專利代理機構(gòu)
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無錫市大為專利商標事務所
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代理人
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時旭丹;劉品超
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國省代碼
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江蘇;32
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主權(quán)項
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人血清白蛋白與人粒細胞集落刺激因子的融合蛋白的制備方法，其特征是從新鮮人外周血中分離單核淋巴細胞，刺激培養(yǎng)，提取RNA，通過RT-PCR反轉(zhuǎn)錄得到G-CSFcDNA；通過PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增獲得HSAcDNA；利用重疊PCR技術，連接HSAcDNA和G-CSFcDNA，中間不加入任何連接肽，得到的HSA-GCSFcDNA融合基因插入到克隆載體，HSA-GCSFcDNA融合基因在宿主系統(tǒng)進行表達，HSA-GCSFcDNA融合基因被整合到宿主的染色體中； (1)G-CSFcDNA的克隆： 以反轉(zhuǎn)錄PCR得到的G-CSFcDNA第一鏈為模板，通過PCR擴增出G-CSFcDNA，所用的引物如下： p1：5’-CGGAATTCATGACCCCCCTGGGCCCTGC-3’ p2：5’-CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGC-3’ PCR方法如下：50μl的反應體系中加入：10μmol/L的p1和p2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer5μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，G-CSFcDNA第一鏈1μg，加雙蒸水補齊50μl，PCR條件為：95℃變性10分鐘，94℃變性1分鐘，66.5℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環(huán)35次； 通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出0.5kb的目標片段，純化好的目標片段和載體pBluescriptIIKS(+)分別經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜；挑取白色菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；通過PCR，及EcoRI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質(zhì)粒EcoRI和NotI雙酶切位點間區(qū)域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍于-80℃；重組質(zhì)粒命名為pBlue-GCSF，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-GCSF； (2)HSAcDNA的克�。� 利用PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增出HSAcDNA，所用的引物為： PH1：5’-AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’ PH2：5’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’ PCR方法如下：50μl的反應體系中加入：10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer1μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文庫1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為：95℃變性5分鐘，94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環(huán)30次； 通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出1.8kb的目標片段，純化好的目標片段和載體pBlue分別經(jīng)SalI和HindIII雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜；挑取白色菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；通過PCR，及SalI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質(zhì)粒SalI和HindIII雙酶切位點間區(qū)域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍于-80℃；重組質(zhì)粒命名為pBlue-HSA，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-HSA； (3)HSAcDNA和G-CSFcDNA融合基因的克�。� HSAcDNA的PCR擴增，所用引物如下： P1：5’-CGGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCG-3’ P2：5’-CAGGGGGGTGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAA-3’ PCR方法如下：50μl的反應體系中加入：10μmol/L的引物P1和P2各1.5μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer5μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，pBlue-HSA1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為：95℃變性5分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，94℃變性1分鐘，循環(huán)30次； G-CSFcDNA的PCR擴增，所用引物如下： P3：5’-CTGCCTTAGGCACCCCCCTGGGCCCTG-3’ P4：5’-CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGAAC-3’ PCR方法如下：50μl的反應體系中加入：10μmol/L的P3和P4的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer5μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，pBlue-GCSF1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為：95℃變性5分鐘，66.5℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，94℃變性1分鐘，循環(huán)30次； 利用重疊PCR融合G-CSFcDNA和HSAcDNA： 將G-CSF的PCR擴增產(chǎn)物和HSA的PCR擴增產(chǎn)物分別稀釋10倍，再以4∶6比例混合后作為模板，于50μl的反應體系中加入：2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer5μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為：95℃變性5分鐘，60.5℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，94℃變性1分鐘，循環(huán)30次； 通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標條帶
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摘要
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人血清白蛋白與人粒細胞集落刺激因子的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品，屬于長效融合蛋白藥物技術領域。本發(fā)明利用重疊PCR技術，將HSA基因cDNA和G-CSF cDNA進行拼接，中間不加入任何連接肽，得到的HSA-GCSF cDNA融合基因在宿主系統(tǒng)中進行表達，融合基因被整合到宿主的染色體中；本發(fā)明的融合蛋白包括與人血清白蛋白至少85％序列同源的第一區(qū)和與人粒細胞集落刺激因子至少85％序列同源的第二區(qū)，該融合蛋白可以在不改變?nèi)诤系鞍滋匦缘那疤嵯�，進行個別氨基酸殘基的取代、缺失或加入；宿主系統(tǒng)可以是細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞、植物細胞等。本發(fā)明的融合蛋白在保持了人粒細胞集落刺激因子的生理特性的基礎上延長其在體內(nèi)的半衰期，在藥學領域有良好的應用前景。
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國際公布
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