公開(公告)號(hào)
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CN1712547A
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公開(公告)日
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2005.12.28
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申請(qǐng)(專利)號(hào)
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CN200510037778.0
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申請(qǐng)日期
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2005.02.01
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專利名稱
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甲胎蛋白(AFP)mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒
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主分類號(hào)
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C12Q1/68
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分類號(hào)
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C12Q1/68;C12Q1/25
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分案原申請(qǐng)?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(qǐng)(專利權(quán))人
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合肥中科大生物技術(shù)有限公司
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發(fā)明(設(shè)計(jì))人
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魏海明;田志剛;程 民;王宗貴
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地址
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230027安徽省合肥市金寨路96號(hào)科大西區(qū)生命科學(xué)學(xué)院
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頒證日
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國(guó)際申請(qǐng)
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進(jìn)入國(guó)家日期
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專利代理機(jī)構(gòu)
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合肥華信專利商標(biāo)事務(wù)所
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代理人
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余成俊
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國(guó)省代碼
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安徽;34
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主權(quán)項(xiàng)
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甲胎蛋白(AFP)mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒,其特征為:它包含細(xì)胞裂解液I、細(xì)胞裂解液II、RNA洗滌緩沖液I、RNA洗滌緩沖液II、無(wú)RNA酶的水、RNA分離柱、反轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP混合物、逆轉(zhuǎn)錄酶儲(chǔ)存液、PCR反應(yīng)液、探針、標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品;以上各種溶液所用溶劑均為水;(1)、細(xì)胞裂解液I包含0.1mol/LTris-HCl(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸,pH7.6,25℃)、0.1mol/L氯化鈉、0.05mol/L氯化鎂、水;(2)、細(xì)胞裂解液II包含3mol/L異硫氰酸胍、2mol/L鹽酸胍、0.3mol/L醋酸鈉(pH5.2)、0.2%(W/V)SDS(十二烷基硫酸鈉)、水;(3)、RNA洗滌緩沖液I包含0.2mol/L醋酸鈉(pH5.2)、0.1mol/L氯酸鈉、0.1mol/LTris-HCl(pH7.5,25℃)、水;(4)、RNA洗滌緩沖液II包含1.2mol/L檸檬酸鈉、0.5mol/LTris-HCl(pH7.5,25℃)、水;(5)、無(wú)RNA酶的水制備方法為:向去離子水加入DEPC(焦碳酸二乙酯),至終濃度為0.05%(V/V),室溫(22-25℃)放置10-12小時(shí)后,121℃,20min高壓,室溫放置備用。(6)、RNA分離柱是一種硅膠柱,可以特異性結(jié)合RNA,并可用水洗脫RNA,達(dá)到分離純化RNA的目的;(7)、反轉(zhuǎn)錄緩沖液包含9.1μmol/LOligo(dT)12-18、3.6U/μlRnaseInhibitor、72.7mmol/LDTT(二硫蘇糖醇)、182mmol/LTris-HCl(pH8.3,25℃)、273mmol/LKCl、1lmmol/LMgCl2、水;(8)、逆轉(zhuǎn)錄酶儲(chǔ)存液包含20mmol/LTris-HCl(pH7.5,25℃)、100mmol/LNaCl、0.1mmol/LEDTA、1.0mmol/LDTT、50%(V/V)甘油、0.01%(V/V)Nonidetp-40、200U/μl逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、水;(9)、dNTP混合物包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP,為其鈉鹽-水溶液,pH7.0-7.5,四種dNTP濃度均為10mmol/L;(10)、PCR反應(yīng)液包含18.5mmol/LTris-HCI(pH8.3,25℃)、2.78mmol/LMgCI2、92.6mmol/LKCl、上下游引物(0.37μmol/L)、0.1U/μlTaq酶、dNTP混合物(dATP,dCTP,dGTP,dTTP,其濃度均為400nmol/L)、水;上下游引物序列分別為:P1:5’-TGACTCCAGTAAACCCTGGT-3’P2:5’-AGAAATCTGCAATGACAGCC-3’(11)、探針為熒光標(biāo)記探針,其序列為:5’-FAM-TGCTGCACTTCTTCATATGCCAACA-TAMRA-3’探針的濃度為:2μmol/L,TE(10mmol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA,水)溶解;(12)、標(biāo)準(zhǔn)品的序列為:1AGAAATCTGCAATGACAGCCTCAAGTTGTTCCTCTGTTATTTGTGGCTTT51TGCTTCACAAGGTTAATGAGAAACTCTTGCTTCATCGTTTGCAGCGCTAC101ACCCTGAGCTTGGCACAGATCCTTATGGAAAATGAACTTGTCATCAGAGA151ATGCAGGAGGGACATATGTTTCATCCACCACCAAGCTGCTGAAGCATGGC201CTCCTGTTGGCATATGAAGAAGTGCAGCACTGGCCAACACCAGGGTTTAC251TGGAGTCA標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為:106copies/μl,TE(10mmol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA,水)溶解;(13)、對(duì)照品分為陽(yáng)性對(duì)照品與陰性對(duì)照品,陽(yáng)性對(duì)照品為有AFPcDNA的樣品(104copies/μl,TE溶解),陰性對(duì)照品為正常人外周血總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
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摘要
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本發(fā)明涉及一種甲胎蛋白(AFP)mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒,該試劑盒包含總RNA提取液(細(xì)胞裂解液I、細(xì)胞裂解液II、RNA洗滌緩沖液I、RNA洗滌緩沖液II和無(wú)RNA酶的水),反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液,dNTP混合物,逆轉(zhuǎn)錄酶,PCR反應(yīng)液,探針,陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品,對(duì)照品。本發(fā)明通過對(duì)新鮮抗凝外周血提取總RNA,并通過逆轉(zhuǎn)錄mRNA樣品得到cDNA,再結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù),可準(zhǔn)確定量檢測(cè)標(biāo)本中AFP的mRNA的表達(dá)量。本發(fā)明所提供的試劑盒可用于臨床及科研中檢測(cè)腫瘤患者的外周血、骨髓、淋巴結(jié)及癌組織中AFP mRNA的表達(dá),為原發(fā)性肝癌的早期診斷、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、治療方案的確定及預(yù)后的判斷提供重要的參考依據(jù)。
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國(guó)際公布
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