| 公開(公告)號(hào) | CN1314802C |
| 公開(公告)日 | 2007.05.09 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN200410075772.8 |
| 申請(qǐng)日期 | 2004.12.30 |
| 專利名稱 | 利用體細(xì)胞雜交技術(shù)將藏藥材藥效成分轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞的方法 |
| 主分類號(hào) | C12N15/05(2006.01)I |
| 分類號(hào) | C12N15/05(2006.01)I;C12N5/14(2006.01)I;A01H4/00(2006.01)I |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 山東大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 向鳳寧;夏光敏;蔡云飛;李子東;江 莉 |
| 地址 | 250100山東省濟(jì)南市歷下區(qū)山大南路27號(hào) |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 濟(jì)南圣達(dá)專利商標(biāo)事務(wù)所 |
| 代理人 | 鄭華清 |
| 國(guó)省代碼 | 山東;37 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種利用體細(xì)胞雜交技術(shù)將藏藥材藥效成分轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞的方法，其特征在于，步驟如下：1)雙親材料來(lái)源：受體和供體材料的選擇及其胚性愈傷組織和懸浮系的誘導(dǎo)和篩選，獲得培養(yǎng)細(xì)胞；受體材料為柴胡、胡蘿卜或馬鈴薯，供體材料為川西獐牙菜、四數(shù)獐牙菜、管花秦艽、白花假龍膽或濕生扁蕾，取供體材料的幼葉及未成熟種子在MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，愈傷組織在繼代培養(yǎng)基上繼代后，選取胚性愈傷組織作為供體，用胚性愈傷組織建立的胚性懸浮系作為受體；2)受、供體原生質(zhì)體的游離：將受體和供體培養(yǎng)細(xì)胞放入酶液中，于25℃下游離3～4小時(shí)溫育后，用300～400目不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾，500r/min離心收集原生質(zhì)體；3)UV處理供體原生質(zhì)體：將收集的供體原生質(zhì)體用洗液洗一次后，調(diào)成1×106/mL的密度，鋪在直徑3.5cm的玻璃培養(yǎng)皿中成薄層后用UV照射；紫外線照射強(qiáng)度為380μW/cm2/1.0-2.0min；4)雙親原生質(zhì)體的融合與培養(yǎng)：將供體與受體按1∶1的體積比混合均勻，用PEG法誘導(dǎo)融合；融合流程如下：(1)原生質(zhì)體滴加在直徑3.5cm的培養(yǎng)皿中，鋪成一薄層，靜置15分鐘～20分鐘；(2)沿薄層邊緣滴加PEG溶液，靜置15～20分鐘；(3)再加二倍體積的0.225M～0.275M Ca(NO3)2液，靜置10分鐘～15分鐘，重復(fù)一次；(4)吸掉培養(yǎng)皿中液體，洗液洗兩次，每次5分鐘～10分鐘；(5)用P5液體培養(yǎng)基洗一次；(6)用Parafilm封口，25℃避光保濕培養(yǎng)；再生愈傷組織長(zhǎng)至1.5mm～2mm時(shí)挑出，轉(zhuǎn)至MS培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，每天光照12h，光強(qiáng)2000Lux，溫度25℃；5)雜種愈傷組織及植株再生：把長(zhǎng)至1.5mm～2mm的融合再生克隆先挑出，在MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得雜種愈傷組織和再生植株；6)藏藥材體細(xì)胞雜種目標(biāo)性狀的篩選：篩選繁殖系數(shù)高的雜種細(xì)胞系，并利用高壓液相色譜測(cè)定各種雜種細(xì)胞系的有效成分含量，比較分析雜種間差異，獲得生長(zhǎng)快速、藥效成分含量高的雜種細(xì)胞系及其植株；其中，酶液成分：15mg/ml Cellulase Onozuka RS，3mg/ml Pectolyase Y-23，5mM MES，0.6M甘露醇，5mM CaCl2，pH 5.8；洗液成分：0.6M甘露醇，5mM CaCl2，pH 5.8；PEG溶液的配方：2g葡萄糖，1.5g Ca(NO3)2，40g分子量6000的PEG，溶解在100ml無(wú)離子水中，調(diào)pH至7.0，抽濾滅菌；Ca(NO3)2溶液的配方：9g無(wú)水Ca(NO3)2+200ml無(wú)離子水，調(diào)pH至7.0，抽濾滅菌；P5培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基的大量元素+MS培養(yǎng)基的微量元素+B5維生素+500mg/L水解酪蛋白+2mg/L甘氨酸+146mg/L谷氨酰氨+90g/L葡萄糖+975mg/L MES，pH5.6--5.8：MS培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基的大量元素+MS培養(yǎng)基的微量元素+MS維生素+2mg/L甘氨酸+146mg/L谷氨酰氨+30mg/L水解酪蛋白+30mg/L+7g/l蔗糖瓊脂粉，pH5.8--6.0：MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+2mg/L 2，4-D；MS繼代培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+2mg/L 2，4-D+0.5mg/L激動(dòng)素；MS1培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+1mg/L 2，4-D。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開一種利用體細(xì)胞雜交技術(shù)將藏藥材藥效成分轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞的方法，主要步驟包括：1)雙親材料來(lái)源；2)受體、供體原生質(zhì)體的游離；3)UV處理供體原生質(zhì)體；4)雙親原生質(zhì)體的融合與培養(yǎng)；5)雜種愈傷組織及植株再生；6)生長(zhǎng)快速、藥效成分含量高的藏藥材體細(xì)胞雜種細(xì)胞系及其植株的獲得。本發(fā)明是利用體細(xì)胞雜交技術(shù)獲得藥效成分含量高、生長(zhǎng)快速的細(xì)胞系，其優(yōu)勢(shì)在于：可為資源匱乏、難以培養(yǎng)的名貴藏藥材有效成分生產(chǎn)提供直接而簡(jiǎn)便的方法，獲得的藥效成分含量高、生長(zhǎng)快速、遺傳穩(wěn)定的雜種細(xì)胞系可用于藏藥材藥效成分的工業(yè)化生產(chǎn)，將在藏藥材資源有效利用上發(fā)揮重要作用，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益。 |
| 國(guó)際公布 |
