公開(公告)號 | CN100335628C |
公開(公告)日 | 2007.09.05 |
申請(專利)號 | CN200510025775.5 |
申請日期 | 2005.05.12 |
專利名稱 | 分泌人干擾素-α2a的重組卡介苗及其構建方法 |
主分類號 | C12N15/09(2006.01)I |
分類號 | C12N15/09(2006.01)I;C12N15/21(2006.01)I;C12N15/87(2006.01)I;C12Q1/68(2006.01)I;C07H21/00(2006.01)I;A61K38/21(2006.01)I;A61K39/00(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I |
分案原申請?zhí)? | |
優(yōu)先權 | |
申請(專利權)人 | 上海交通大學 |
發(fā)明(設計)人 | 劉海濤;夏術階;孫曉文 |
地址 | 200240上海市閔行區(qū)東川路800號 |
頒證日 | |
國際申請 | |
進入國家日期 | |
專利代理機構 | 上海交達專利事務所 |
代理人 | 毛翠瑩 |
國省代碼 | 上海;31 |
主權項 | 一種分泌人干擾素-α2a的重組卡介苗的構建方法,其特征在于包括如下步驟:1)卡介苗穿梭表達載體的構建:分別設計編碼Ag85B信號肽的基因片段和IFN-α2a的擴增引物,編碼Ag85B信號肽的基因片段的上下游酶切位點分別為BamHI和EcoRI,IFN-α2a的上下游酶切位點分別為EcoRI和SalI,經聚合酶鏈式反應分別合成編碼Ag85B信號肽的基因片段和IFN-α2a基因片段,將編碼Ag85B信號肽的基因片段克隆到pMV261載體中,得到pMS,再將IFN-α2a基因片段與pMS載體編碼Ag85B信號肽的基因片段連接,得到穿梭表達載體pMSIFN-α2a;2)卡介苗的培養(yǎng):選取卡介苗為上海丹麥株,將卡介苗放在含有液體培養(yǎng)基的燒瓶中進行搖床培養(yǎng),液體培養(yǎng)基含有10%的營養(yǎng)劑ADC、0.5%吐溫80和0.2%甘油,搖床培養(yǎng)100轉/分,三周后卡介苗處于對數生長期,OD600值=0.6,制得感受態(tài)卡介苗;3)電轉化技術構建重組卡介苗rBCGIFN-α2a:在一離心管中混勻400μl含1×108cfu的感受態(tài)卡介苗和2μl含0.4μg的穿梭表達載體pMSIFN-α2a,置于基因脈沖儀中進行電轉化得到陽性重組子,電轉參數:電壓為2500V,電容為25μF,電阻為1000Ω,陽性重組子先在含有50μg/ml卡那霉素的固體培養(yǎng)基中篩選,培養(yǎng)兩周后得到陽性克隆rBCGIFN-α2a,然后接種在含有50μg/ml卡那霉素的液體培養(yǎng)基搖床生長,大量培養(yǎng);4)重組卡介苗rBCGIFN-α2a的鑒定與功能檢測:進行抗酸染色初步確定rBCGIFN-α2a為抗酸桿菌,抽提rBCGIFN-α2a質粒DNA后,PCR擴增得到IFN-α2a的基因片段,WesternBlot檢測到rBCGIFN-α2a培養(yǎng)上清中和菌體中有IFN-α2a蛋白的表達,ELISA方法檢測到rBCGIFN-α2a培養(yǎng)上清中有高含量的IFN-α2a。 |
摘要 | 本發(fā)明涉及一種分泌人干擾素-α2a的重組卡介苗及其構建方法,利用基因工程技術將起分泌作用的卡介苗Ag85B信號肽片段和人IFN-α2a的基因克隆至pMV261,得到卡介苗穿梭表達載體pMSIFN-α2a,然后采用電穿孔技術將pMSIFN-α2a導入BCG構建重組卡介苗rBCGIFN-α2a,依靠pMSIFN-α2a在BCG的復制和信號肽的分泌作用,能夠高效分泌IFN-α2a。本發(fā)明得到的重組卡介苗rBCGIFN-α2a具有BCG和IFN-α2a的雙重效果,能夠有效預防和治療淺表性膀胱腫瘤;利用重組卡介苗rBCGIFN-α2a在膀胱腔內的局部協(xié)同作用減少BCG和外用IFN-α2a的用量,可以克服BCG治療的毒副作用。 |
國際公布 |