| 公開(公告)號 | CN100340656C |
| 公開(公告)日 | 2007.10.03 |
| 申請(專利)號 | CN02136853.8 |
| 申請日期 | 2002.09.06 |
| 專利名稱 | 人γ-干擾素在畢赤酵母菌中的高效表達(dá)、發(fā)酵和純化 |
| 主分類號 | C12N1/19(2006.01)I |
| 分類號 | C12N1/19(2006.01)I;C12N15/81(2006.01)I;C12N15/23(2006.01)I;C12P21/00(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 上海擎天生物制藥技術(shù)開發(fā)有限公司 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 陳國富 |
| 地址 | 200000上海市浦東張江高科技園區(qū)郭守敬路351號2號樓624－6室 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 上海浦一知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 |
| 代理人 | 丁紀(jì)鐵 |
| 國省代碼 | 上海;31 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種由基因工程菌發(fā)酵制備人γ-干擾素的方法，其特征在于，基因結(jié)構(gòu)如下的人γ-干擾素基因序列，ATGCAAGACCCATACGTCAAGGAGGCAGAAAACTTGAAGAAATATTTTAACGCTGGTCATMQDPYVKEAENLKKYFNAGHTCTGACGTGGCAGACAATGGAACATTATTTTTGGGTATTTTGAAGAAGTGGAAAGAAGAGSDVADNGTLFLGILKNWKEETCAGATAGAAAGATTATGCAATCCCAGATCGTCTCCTTCTACTTCAAGCTTTTCAAGAACSDRKIMQSQIVSFYFKLFKNTTCAAAGATGATCAATCCATCCAAAAATCCGTTGAGACAATCAAAGAGGATATGAATGTCFKDDQSIQKSVETIKEDMNVAAGTTCTTTAACTCTAATAAGAAGAAGCGTGATGACTTTGAGAAGTTGACCAATTACTCAKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSGTTACAGACTTGAATGTCCAACGTAAGGCAATCCACGAGCTGATTCAAGTGATGGCAGAAVTDLNVQRKAIHELIQVMAECTTTCTCCAGCTGCTAAAACCGGAAAGAGAAAGAGGTCTCAAATGTTGTTTAGAGGAAGALsPAAKTGKRKRAQMLFRGRCGTGCTTCTCAATAGRASQTerm克隆插入帶有甲醇調(diào)節(jié)型啟動子AOX1的載體pPIC3.5K中，獲得表達(dá)載體pPIC3.5K-ifn，采用蛋白酶缺陷的畢赤酵母SMD1163為宿主，用G418抗性濃度遞增法篩選多拷貝克隆，得高表達(dá)畢赤酵母株(PichiaPastoris)SMD1163(pPIC3.5K-ifn，his4pep4Δprbl)-181CGMCCNO.0758，經(jīng)發(fā)酵，純化得人γ-干擾素。 |
| 摘要 | 設(shè)計(jì)并人工合成了特別適合于畢赤酵母菌(Pichia pastoris)中表達(dá)的人γ-干擾素的基因序列，構(gòu)建了胞內(nèi)表達(dá)人γ-干擾素蛋白的載體pPIC3.5K-ifn，采用蛋白酶缺陷的畢赤酵母SMD1163為宿主菌，用G418抗性濃度遞增法篩選多拷貝克隆，得高表達(dá)克隆株P(guān)ichia pastoris SMD1163(Ppic3.5K-ifn，his4 pep4 Δprb1)-181。該菌在28-30℃不含甲醇的培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)，再在含1％的甲醇的誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)36-48小時(shí)，γ-干擾素表達(dá)量可達(dá)菌體總蛋白的25％。每升含γ-干擾素初品約為1克左右。經(jīng)DEAE-Sepharose凝膠吸附，Sephacry S-200分子篩層析，DEAE-Sepharose陰離子交換層析，CM-Sepharose陽離子交換層析，得純度為97.5％以上(HPLC)的人γ-干擾素蛋白。 |
| 國際公布 |
