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A.倒置顯微鏡下觀察(×100);B.心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察(×20 000)
2.2 心肌細(xì)胞成活率的測(cè)定 取細(xì)胞懸液，稀釋到109/L，用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色，未著色的為活細(xì)胞,呈藍(lán)色的為死細(xì)胞,顯微鏡下觀察并計(jì)算心肌細(xì)胞的成活率，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，11個(gè)染藍(lán)色，成活率為94.5%。
2.3 pNI4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后倒置顯微鏡觀察結(jié)果 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前的心肌細(xì)胞在倒置顯微鏡下可見(jiàn)：心肌細(xì)胞伸展為圓形、梭形、棒狀、星狀及分叉狀等;胞核多為1個(gè)，間或多個(gè)，核呈圓形，核仁清晰;可見(jiàn)到自發(fā)性搏動(dòng)，但節(jié)律不一，慢的1 min僅數(shù)次，快的可達(dá)120次/min以上;細(xì)胞間形成細(xì)胞簇，可出現(xiàn)同簇細(xì)胞的同步搏動(dòng)(圖2A)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后第3天，心肌細(xì)胞數(shù)量減少，心肌細(xì)胞主要為梭形和分叉狀;胞核為1～2個(gè)，核呈圓形，但是核仁不清晰;仍然可以見(jiàn)到自發(fā)性搏動(dòng)，但是節(jié)律不齊;可見(jiàn)到心肌細(xì)胞呈空泡樣改變，很難看見(jiàn)成簇的心肌細(xì)胞(圖2B)。圖2 pNI4轉(zhuǎn)染前后的心肌細(xì)胞形態(tài)比較(×400)
A.轉(zhuǎn)染前;B.轉(zhuǎn)染后
2.4 CVB3m攻擊后心肌細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果 CVB3m病毒攻擊后3天左右，倒置顯微鏡下可見(jiàn)成纖維細(xì)胞破裂崩解，細(xì)胞核固縮，飄浮在培養(yǎng)液中。心肌細(xì)胞沒(méi)有出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變(CPE)，仍然搏動(dòng)但是較慢、不規(guī)則，心肌細(xì)胞仍然貼壁生長(zhǎng)(圖3);超微結(jié)構(gòu)觀察可見(jiàn)心肌細(xì)胞呈矩形，核位于質(zhì)膜下，核周細(xì)胞器豐富，核膜增厚，細(xì)胞核形狀可見(jiàn)畸變，核內(nèi)染色質(zhì)明顯固縮，細(xì)胞膜和肌原纖維基本完整，但是線粒體膜部分破裂，線粒體嵴呈絮狀改變或者腫脹而大小不一，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)到結(jié)晶狀的病毒顆粒，呈黑色點(diǎn)狀排列(圖4)。圖3 CVB3m感染的心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(×100)
2.5 pNI4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后心肌酶檢測(cè)結(jié)果 分別在轉(zhuǎn)染前(1、3天)和轉(zhuǎn)染后(1、3、6天)吸取細(xì)胞上清液，凍存后使用日立7600型生化自動(dòng)分析儀來(lái)測(cè)定心肌細(xì)胞酶。結(jié)果顯示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，病毒在心肌細(xì)胞中合成復(fù)制，導(dǎo)致心肌細(xì)胞部分破裂崩解，致使心肌酶都有不同程度的升高(表1);經(jīng)過(guò)3天以后，心肌酶開(kāi)始下降，有的降到了非常低的水平，此時(shí)的心肌細(xì)胞仍然存活并可見(jiàn)搏動(dòng)。
2.6 CVB3m病毒攻擊后心肌酶檢測(cè)結(jié)果 病毒接種后留1孔做空白對(duì)照，比較加病毒后心肌酶的變化。結(jié)果可見(jiàn)，病毒感染心肌細(xì)胞后，雖然沒(méi)有出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，但是在病毒感染的情況下心肌酶的釋放會(huì)升高(表2)。表1 pNI4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后心肌酶測(cè)定結(jié)果(2批心肌細(xì)胞測(cè)定后取平均值)表2 病毒接種后心肌細(xì)胞酶測(cè)定(2批心肌細(xì)胞測(cè)定后取平均值)
2.7 RT-PCR擴(kuò)增CVB3病毒5′-UTR的結(jié)果 為了證明心肌細(xì)胞中有CVB3存在，并且病毒處于持續(xù)感染狀態(tài)，吸取質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后和病毒感染后的心肌細(xì)胞的上清液，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增病毒的5′-UTR(Mastercycler gradient PCR)，結(jié)果如圖5所示，擴(kuò)增到特異性大小的目的片斷，均為750 bp。
圖5 RT-PCR擴(kuò)增CVB3病毒5′-UTR
1.CVB3m陽(yáng)性對(duì)照;2.pNI4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后心肌細(xì)胞的上清液;3.CVB3m感染心肌細(xì)胞后的病毒上清液;4.陰性對(duì)照;M.DL 2 000 Marker
3 討 論
3.1 心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng) 自1960 年Harary首次對(duì)Wistar 乳鼠的心肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并成功維持自發(fā)性搏動(dòng)長(zhǎng)達(dá)40天以來(lái)，國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者開(kāi)展了離體心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、生理、代謝、病理、藥理等方面的研究。本實(shí)驗(yàn)的方法在前人方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，體外分離和培養(yǎng)Balb/c乳鼠心肌細(xì)胞，并成功地獲得了很高的成活率和純度!
培養(yǎng)24 h后存活的心肌細(xì)胞即可貼壁生長(zhǎng)，而破壞嚴(yán)重的心肌細(xì)胞難于貼壁而懸浮于培養(yǎng)液中并逐漸腫脹、破裂而死，此時(shí)更換培養(yǎng)液可進(jìn)一步提高心肌細(xì)胞的存活率;利用actin免疫熒光檢測(cè)，證明我們獲得的Balb/c乳鼠原代心肌細(xì)胞純度達(dá)95%;心肌細(xì)胞搏動(dòng)表明具有自律性的心肌細(xì)胞活性和狀態(tài)良好。
通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)：①最好選擇1～4天內(nèi)的新生鼠進(jìn)行原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)，尤其是3天內(nèi)培養(yǎng)更好;②嚴(yán)格無(wú)菌操作，打開(kāi)胸腔后迅速摘取跳動(dòng)的心臟，操作要熟練快捷;③利用BrdU對(duì)成纖維細(xì)胞的抑制作用，以及差速貼壁等方法，可以極大地純化心肌細(xì)胞;④消化過(guò)程是影響心肌細(xì)胞存活率的重要因素，胰蛋白酶可分解組織間質(zhì)的蛋白成分,但對(duì)肌細(xì)胞膜蛋白亦起較強(qiáng)的破壞作用[4]，故對(duì)其作用時(shí)間和濃度的要求較為嚴(yán)格。而每次實(shí)驗(yàn)都可能有細(xì)微差別，所以應(yīng)結(jié)合肉眼觀察消化情況及時(shí)終止消化，不宜固定精確的消化時(shí)間。膠原酶可消化細(xì)胞間質(zhì)的膠原纖維以釋放細(xì)胞，作用較緩和，對(duì)細(xì)胞損傷較小;經(jīng)過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，我們認(rèn)為單一使用胰蛋白酶消化對(duì)細(xì)胞損傷大，聯(lián)合使用膠原酶將膠原纖維充分消化后利于離心時(shí)細(xì)胞沉淀,提高心肌細(xì)胞存活率，細(xì)胞貼壁早，搏動(dòng)出現(xiàn)亦早[5]。第1次消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)丟棄一些已消化下來(lái)的心肌細(xì)胞。終止消化后的消化產(chǎn)物應(yīng)立即離心，而后用培養(yǎng)液重懸以使受損的細(xì)胞盡早恢復(fù)。消化過(guò)程中反復(fù)吹打使酶與組織充分均勻接觸，使心肌細(xì)胞呈單個(gè)分散狀態(tài)從而減少消化次數(shù)和時(shí)間，提高細(xì)胞存活率。吹打不充分細(xì)胞團(tuán)塊占5% 以上會(huì)大大降低心肌細(xì)胞的收獲率，并且從團(tuán)塊中爬出來(lái)的成纖維細(xì)胞影響心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)和純度[6]。⑤培養(yǎng)液是維持細(xì)胞生存的基本條件，心肌細(xì)胞在偏酸性環(huán)境中(pH值7.0～7.2) 更利于生長(zhǎng)，培養(yǎng)液儲(chǔ)存后pH值逐漸升高，最好現(xiàn)配現(xiàn)用。抗生素的藥效濃度與毒效濃度接近，對(duì)細(xì)胞可造成損害，實(shí)驗(yàn)中注意無(wú)菌操作可有效預(yù)防污染，故培養(yǎng)液盡量少加抗生素[7]醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站quanxiangyun.cn。
