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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 病毒 CVB3m由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室惠贈(zèng)。
1.1.2 質(zhì)粒、細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 pNI4質(zhì)粒含CVB1 cDNA全序列[3]，由日本東京大學(xué)Narushi Iizuka教授惠贈(zèng);HeLa細(xì)胞和工程菌株E. coli DH5α均購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室;Balb/c乳鼠(出生4天內(nèi))購自徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
1.1.3 主要酶類及試劑盒 質(zhì)粒小量提取試劑盒W5001及DNA小量膠回收試劑盒W5211購自上海華舜生物工程公司。真核轉(zhuǎn)染試劑Tfx-50為Promega公司產(chǎn)品。RNA提取試劑盒TRIzol Reagent為Invitrogen公司產(chǎn)品。Thermo ScriptTM RT-PCR試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品。限制性核酸內(nèi)切酶EcoR V、ClaI、PstI、堿性磷酸酶CIAP及Wide rang DNA ladder marker均為Takara公司產(chǎn)品。
1.1.4 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基(GIBCO公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，胰蛋白酶(GIBCO公司)，膠原酶Ⅱ(Sigma公司)，兔抗小鼠肌動(dòng)蛋白(actin)抗體(Santa Cruz公司)，羊抗兔IgG-TRITC(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)，5′-溴-2′-脫氧尿苷(BrdU，Sigma公司)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.1.5 細(xì)胞培養(yǎng)液 DMEM/F12，pH 7.2～7.4，使用時(shí)加入15%胎牛血清，1%雙抗。消化液為0.2%胰蛋白酶和0.1%膠原酶Ⅱ混合液(1∶1)。BrdU用去離子水配制，加入到15%DMEM/F12培養(yǎng)液中，終濃度為0.1 mmol/L，可以抑制非心肌細(xì)胞的生長。
1.1.6 50×TAE電泳緩沖液 Tris堿242 g、冰乙酸57.1 ml、0.5 mol/L pH 8.0的EDTA 100 ml溶于終體積1 000 ml 去離子水中，使用時(shí)1∶50倍稀釋;10×加樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)、0.25%二甲苯青、30%甘油混勻后保存于4℃;10 g/L溴化乙錠(EB)溶液：0.2 g EB溶于20 ml去離子水中，混勻后4℃避光保存，使用時(shí)終濃度為0.5 g/L;0.7%和1%瓊脂糖凝膠：0.7%和1%瓊脂糖分別溶于1×TAE中。
1.2 方法
1.2.1 乳鼠心肌的取材 取出生1～4天內(nèi)的Balb/c乳鼠，75%乙醇消毒皮膚，無菌條件下從胸腔取出心臟，取出的心臟立即放入裝有預(yù)熱37℃的D-Hanks液的培養(yǎng)皿中，可見到心臟仍然保持搏動(dòng)。
1.2.2 乳鼠心肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 取出的心臟在加有37℃的D-Hanks液的平皿中，洗1～2次，置于無血清無雙抗的DMEM/F12中，并在其中把心臟剪成體積為1 mm3的小塊;事先準(zhǔn)備好2支離心管， 第1支加入5 ml左右15%DMEM/F12培養(yǎng)液(含血清和雙抗)，第2支空，其中第1支放入4℃冰箱中備用。將小塊的心肌放入第2支空著的離心管中，并加入1.5 ml消化液，然后放入到事先準(zhǔn)備好的37℃的水浴鍋中消化，每次消化11 min，棄上清(保持溫度在37℃)，重復(fù)3次;第4次加入消化液2 ml，消化20 min，每隔5 min搖勻，每隔10 min吹吸，以加速心肌細(xì)胞的消化，20 min后將消化液吸出，放入在4℃冰箱中的離心管中，重復(fù)3次。將收集好的心肌細(xì)胞1 500 r/min離心7 min，棄上清，用5 ml預(yù)熱37℃ 的15%DMEM/F12培養(yǎng)液重懸;在無菌平皿中用濾網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液以去除大塊有形成分;將過濾好的細(xì)胞液收集到培養(yǎng)瓶中，置于37℃ 5% CO2孵箱中培養(yǎng)2 h，吸出尚未貼壁的細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到24孔培養(yǎng)板中，置于37℃ 5% CO2孵箱中培養(yǎng)， 48 h后換液，以后每3～4天更換培養(yǎng)液1次。定期在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長的情況并攝影記錄。
1.2.3 心肌細(xì)胞的鑒定 ①倒置顯微鏡下常規(guī)觀察細(xì)胞的生長情況，并可見心肌細(xì)胞的搏動(dòng);②超微結(jié)構(gòu)觀察：培養(yǎng)的細(xì)胞用消化液消化后，1 500 r/min離心、收集心肌細(xì)胞，戊二醛固定，送電鏡中心，透射電鏡觀察并攝片。
1.2.4 pNI4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞 在轉(zhuǎn)染前把心肌細(xì)胞的培養(yǎng)液換成無雙抗培養(yǎng)液培養(yǎng)，當(dāng)心肌細(xì)胞90%成層分布后開始轉(zhuǎn)染，按照轉(zhuǎn)染試劑盒的說明進(jìn)行。每天倒置顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞的變化，并在轉(zhuǎn)染后的第1、3、6天吸取心肌細(xì)胞的上清液凍存，測定心肌酶。
1.2.5 嗜心肌毒株CVB3m攻擊心肌細(xì)胞 培養(yǎng)的心肌細(xì)胞90%成層分布后進(jìn)行病毒接種。方法如下：棄上清，每孔加入稀釋好的病毒100 μl，37℃ 5% CO2孵箱中孵育1 h，加入細(xì)胞培養(yǎng)液至1 ml，37℃ 5% CO2孵箱中培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞的變化，并在不同的時(shí)間段吸取細(xì)胞上清液，測定心肌酶譜和提取病毒RNA，最后用消化液消化、1 500 r/min離心、收集心肌細(xì)胞，戊二醛固定，超薄切片，透射電鏡觀察心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站quanxiangyun.cn。
2 結(jié) 果
2.1 心肌細(xì)胞形態(tài)觀察 倒置顯微鏡下，消化后的心肌細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞數(shù)為4.8×109/L，2 h后開始貼壁生長，心肌細(xì)胞伸展為圓形、梭形、棒狀、星狀及分叉狀等，1～2個(gè)呈圓形的胞核，核仁清晰可見，可見心肌細(xì)胞搏動(dòng)，頻率為20～30次/min，搏動(dòng)細(xì)胞達(dá)70%，搏動(dòng)頻率有所不同;24 h后95%的細(xì)胞均有搏動(dòng)，當(dāng)生長成片后可見島嶼狀搏動(dòng)，搏動(dòng)頻率為80～150次/min(圖1A);超微結(jié)構(gòu)觀察顯示，培養(yǎng)的心肌細(xì)胞肌絲發(fā)達(dá)，游離的核糖體、糖原及線粒體豐富，肌節(jié)明顯，粗肌絲與細(xì)肌絲相間排列形成明顯的Z 線。相鄰心肌細(xì)胞之間伸出許多突起，由中間連接、橋粒及縫隙連接構(gòu)成閏盤結(jié)構(gòu)。線粒體多分布于核周或排列在肌絲之間，嵴呈板狀， 與線粒體長軸垂直或平行，密集排列。心肌細(xì)胞核為1～ 2個(gè)，橢圓形，核仁清晰，染色質(zhì)分布均勻(圖1B)。圖1 原代培養(yǎng)Balb/c乳鼠心肌細(xì)胞形態(tài)觀察
