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1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源及分組
雄性SD大鼠36只,體質(zhì)量150～200g,由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為正常對照組(A組)、哮喘模型組(B組)、姜黃素治療組(C組)各12只。
1.2 試劑與藥品
98%純度姜黃素由廣東醫(yī)學(xué)院天然藥物開發(fā)中心提供。卵白蛋白(Ovalbumin,OVA,V級):美國Sigma公司; GM-CSF探針由上海生物工程技術(shù)有限公司合成，探針序列為3-CTGACGACCCTCGCTGGT-CAGGTCC-5'。
1.3 模型的建立
參照文獻(xiàn)[3]方法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)的第1、3天,B、C組大鼠腹腔注射抗原液1ml(含卵蛋白100mg,滅活百日咳桿菌疫苗5×109個(gè),氫氧化鋁干粉100mg)致敏, A組用等量的生理鹽水替代抗原液。第10天后,B、C組以1%卵蛋白溶液霧化吸入,30min激發(fā),動(dòng)物出現(xiàn)打噴嚏、呼吸頻率加快、幅度加大、腹式呼吸明顯等癥狀。以后每天激發(fā)1次,共15次。C組大鼠于每次激發(fā)前20min胃飼姜黃素200mg/kg藥液,B組大鼠鼻飼等量生量鹽水。第24天取材。
1.4 標(biāo)本采集
末次激發(fā)后2～4h內(nèi)處死大鼠。開胸,取右肺臟冷生理鹽水清洗后,置于-60℃凍存?zhèn)溆谩?/P>
1.5 肺泡灌洗液總細(xì)胞數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)
氣管插管，用生理鹽水5ml注入左側(cè)氣管肺組織內(nèi)，反復(fù)抽吸3次，回收率80%以上，將抽取得肺泡灌洗液取20μl用以細(xì)胞記數(shù)，剩余放入離心管中，100r/min，離心后沉淀用1ml生理鹽水稀釋，涂片，瑞氏-姬姆薩染色計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞觀察細(xì)胞分類情況。
1.6 肺組織GM-CSFmRNA原位雜交檢測
取肺組織冰凍切片,0.1MPBS漂洗5min,0.3%TritonX-100 20min,蛋白酶K(2ng/ml)37℃,30min,4%多聚甲醛5min,(1.33%三乙醇胺+0.25%乙酸酐)/0.1MTris-HCL,pH 8.0 10min,2×SSC漂洗10min,雜交液(每片加含有GM-CSF探針標(biāo)記液20μl),45℃下,20h,4×SSC,37℃下、15min,2×SSC,37℃下,30min,依次轉(zhuǎn)入1×SSC、0.5×SSC,37℃下各10min,0.5MPBS漂洗5min,加Anti-Dig-Ap抗(1∶1000)37℃下,1h,轉(zhuǎn)入4℃下,20h,TSM1、TSM2各10min,NBT/BCIP顯色3～4h,0.05MPBS漂洗,終止反應(yīng),中性樹膠封片。雜交前所需液體及試劑均需DEPC無RNAase處理醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站quanxiangyun.cn。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
結(jié)果以(x±s)表示,應(yīng)用sas 8.1軟件包進(jìn)行單因素方差分析、F檢驗(yàn)、相關(guān)分析。P<0.05認(rèn)為組間有顯著性差異,P<0.01認(rèn)為組間有極顯著性差異。
2 結(jié)果
2.1 大鼠哮喘癥狀發(fā)作程度
于第1次激發(fā)后,B、C組大鼠出現(xiàn)明顯呼吸變促、煩躁、打噴嚏等癥狀。連續(xù)抗原激發(fā)后,B組大鼠癥狀嚴(yán)重,即刻出現(xiàn)噴嚏,煩躁不安,呼吸急促,有喘鳴音,嚴(yán)重者出現(xiàn)行動(dòng)遲滯,反應(yīng)遲鈍,且持續(xù)時(shí)間長。A組無癥狀,C組大鼠癥狀較輕,表現(xiàn)為氣促、煩躁。
2.2 哮喘大鼠肺泡灌洗液總細(xì)胞數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)
哮喘模型組總細(xì)胞數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)均明顯高于姜黃素組及對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表1。表1 各組大鼠肺泡灌洗液總細(xì)胞數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)情況 (略)
