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免疫學(xué)實驗指導(dǎo)-實驗五 其它免疫學(xué)試驗

免疫學(xué)實驗指導(dǎo):實驗五 其它免疫學(xué)試驗:第五部分 其它免疫學(xué)試驗實驗一 結(jié)核菌素試驗【原理】結(jié)核菌素試驗是最常用的遲發(fā)型超敏反應(yīng)皮膚試驗,是體內(nèi)測定機體細胞免疫功能狀態(tài)的方法之一。結(jié)核菌素是結(jié)核桿菌的菌體成分,注入機體后,如受試者曾經(jīng)受過結(jié)核桿菌的感染,則結(jié)核菌素與致敏淋巴細胞特異性結(jié)合,釋放淋巴因子,在注射局部形成遲發(fā)型超敏反應(yīng)性炎癥,出現(xiàn)紅腫、硬結(jié)。如受試者未受過結(jié)核桿菌的感染或未接種過BCG,則無超敏反應(yīng)發(fā)生。故結(jié)核菌素試驗可用來

第五部分  其它免疫學(xué)試驗

實驗一  結(jié)核菌素試驗

原理

結(jié)核菌素試驗是最常用的遲發(fā)型超敏反應(yīng)皮膚試驗,是體內(nèi)測定機體細胞免疫功能狀態(tài)的方法之一。結(jié)核菌素是結(jié)核桿菌的菌體成分,注入機體后,如受試者曾經(jīng)受過結(jié)核桿菌的感染,則結(jié)核菌素與致敏淋巴細胞特異性結(jié)合,釋放淋巴因子,在注射局部形成遲發(fā)型超敏反應(yīng)性炎癥,出現(xiàn)紅腫、硬結(jié)。如受試者未受過結(jié)核桿菌的感染或未接種過BCG,則無超敏反應(yīng)發(fā)生。故結(jié)核菌素試驗可用來測定機體是否有過結(jié)核桿菌的感染或BCG的接種效果,亦可用于檢測機體的細胞免疫功能狀態(tài)。此外用動物檢查結(jié)核標(biāo)本時,在接種前或后也常用此試驗來測定動物對結(jié)核桿菌的感染狀況。

材料

   豚鼠(約250克)、舊結(jié)核菌素、注射器、碘酒、酒精、針頭等。

方法

1.取白色豚鼠(約250克),從皮下接種卡介苗1~2次,一個月后取同一豚鼠,剃去腹部一部分毛,用碘酒、酒精消毒后,于皮內(nèi)注射0.1毫升11000稀釋的結(jié)核菌素。

2.注射后72h觀察結(jié)果。

結(jié)果

注射部位有紅腫、硬結(jié),其直徑超過1cm時,即為陽性反應(yīng);無任何變化者,則為陰性反應(yīng)。

注意事項

 1.本試驗不宜用于結(jié)核活動期患者,特別是結(jié)核活動期嬰幼兒。

2.常規(guī)試驗陰性者,可分別再用1∶1000、1∶100舊結(jié)核菌素作皮試,若仍為陰性者方可判斷為陰性反應(yīng)。

思考題

為什么結(jié)核菌素試驗可用于檢測機體的細胞免疫功能狀態(tài)?

                     

實驗二  實驗動物過敏癥

實驗動物過敏癥屬于Ι型超敏反應(yīng),與臨床常見的青霉素和異種動物血清引起的過敏性休克相似,通過實驗可進一步加深對Ι型超敏反應(yīng)機理的理解,提高醫(yī)護人員對人類過敏性休克重要性的認識。

原理

 先給動物注射異種蛋白,經(jīng)過一定時間后,動物產(chǎn)生的IgE類抗體結(jié)合于肥大細胞和嗜堿性粒細胞上,動物處于致敏狀態(tài)。當(dāng)?shù)诙谓o動物注射較大量相同抗原時,抗原與IgE結(jié)合,導(dǎo)致肥大細胞和嗜堿性粒細胞脫顆粒,釋放活性介質(zhì),作用于效應(yīng)器官,產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏性休克。

材料

1.動物  豚鼠(250克左右)。

2.抗原  人血清、雞蛋清。

3.無菌注射器、針頭、碘酒、酒精等。

方法

1.取健康豚鼠2只,以 甲、乙編號,分別從甲、乙2 只豚鼠的腹腔或皮下注射1∶10稀釋的人血清0.1毫升,使動物致敏。

2.致敏后14~21d,取甲豚鼠給以心臟注射未稀釋的人血清1~2毫升,乙豚鼠給以心臟注射未稀釋的雞蛋清1~2毫升。

3.注射后,1~5分鐘觀察動物的狀態(tài)。

結(jié)果

1.注射人血清者經(jīng)幾分鐘后,即出現(xiàn)煩燥不安,抓鼻、聳毛、咳嗽、打噴嚏等現(xiàn)象,繼而發(fā)生呼吸困難、大小便失禁,全身倒向一側(cè),休克死亡。而注射雞蛋清者無任何癥狀出現(xiàn)。

2.豚鼠解剖觀察肺臟的變化,可見甲豚鼠肺臟極度氣腫,而乙豚鼠

肺臟正常。

注意事項

 1.致敏途經(jīng)除皮下外,還可以釆用腹腔免疫,一般在注射后2~3周,動物即可達到高致敏狀態(tài),并可維持幾個月。在此期間用相同抗原進行再次注射時,可引起休克反應(yīng)。

2.作抗原再次注射時,應(yīng)采用靜脈或心內(nèi)注射的途徑,使抗原直接進入循環(huán),才能引起明顯的休克反應(yīng),如采用腹腔或皮下注射,只能產(chǎn)生延緩性休克,甚至不發(fā)生休克反應(yīng)。

   【思考題

結(jié)合動物實驗,解釋Ι型超敏反應(yīng)發(fā)生的機理,并說明為什么乙豚鼠無超敏反應(yīng)發(fā)生?

                     

實驗三 溶血空斑試驗

   【原理

溶血空斑試驗(Plaque Forming Cell assay, PFC試驗),是體外檢查和計數(shù)產(chǎn)生IgM(直接法)和其他類型Ig(間接法)的抗體生成細胞的一種方法。具有特異性高、篩檢力強、能直接觀察等優(yōu)點,可作為判斷機體體液免疫功能的指標(biāo)之一。直接法是取經(jīng)SRBC免疫后第4天的小鼠脾臟,制成脾細胞懸液后,加入SRBC和補體一起混勻于瓊脂糖液中,于37℃溫育后,淋巴細胞釋放溶血素(抗SRBC抗體),溶血素與周圍的SRBC結(jié)合,在補體參與下導(dǎo)致細胞周圍的SRBC溶解,在淋巴細胞周圍形成一個肉眼可見的透明溶血圈(溶血空斑)。間接法是在脾細胞(約免疫l0d后),SRBC和補體反應(yīng)系統(tǒng)中再加入高度特異性的抗Ig類血清,例如要檢測IgG抗體生成細胞則要加入抗鼠IgG抗血清,其余操作均同直接法。本試驗僅介紹直接法。

材料

1.20%SRBC懸液(用Hanks液配制)。

2.補體 新鮮豚鼠血清(用前經(jīng)靶細胞吸收,l ml壓積SRBC加20ml補體,充分混勻,而后置4℃20min吸收,離心1000rpm,10min,取上清,用Hanks液稀釋為l∶10)。

3.右旋糖酐(DEAE-dextran,分子量50萬,用蒸餾水配制成l0mg/m1,阻止瓊脂的抗補體作用)。

4.瓊脂或瓊脂糖(表層基0.7%,底層基1.4%用Hanks配制)。

5.胎牛血清(56℃30min滅活,并經(jīng)羊紅細胞吸收)。

6.Hanks液。

7.水浴箱調(diào)至47~49℃。

8www.med126.com.1ml注射器和青霉素小瓶。

9.玻璃平皿(7×1.5cm)。

10.動物  體重18~25g的純系小鼠。

11.0.5%臺盼藍染液。

12.其他器材 剪刀、鑷子、解剖板、血球計數(shù)板、注射器、紗布、試管等。

方法

1.將溶化的底層瓊脂傾注平皿內(nèi),成一薄層,待凝固備用。

2.將每管含2ml表層基的試管加熱融化后,放47~49℃水浴保溫。

3.SRBC懸液的制備

以無菌操作抽取綿羊血。保存于阿氏(Alsevers)液內(nèi),置4℃保存,一般不超過2周。實驗時取保存的羊血,用生理鹽水洗滌三次,每次離心2000rpm,5min,制成SRBC懸液,計數(shù),然后按實驗需要配制成20%及2×109/ml的紅細胞懸液。

4.免疫小鼠脾細胞懸液的制備

⑴ SRBC免疫小鼠  最好用純系鼠,體重25g左右,腹腔注射綿羊紅細胞(2×109個/m1)0.5ml或尾靜脈注射0.2ml。測定直接溶血空斑,用免疫后4d的鼠;測定間接溶血空斑,用免疫后10d的鼠。

⑵ 將免疫小鼠拉脫頸椎致死。暴露腹腔,取出脾臟放在周圍有碎冰塊的小瓶內(nèi),先用1ml注射器尖端將其搗碎,再加冷Hanks液數(shù)毫升,用注射器抽吸吹打,使細胞分散均勻。經(jīng)尼龍布(或八層紗布)過濾離心去上清,將細胞用冷Hanks液洗滌兩次,再將沉淀的細胞重懸于1ml冷Hanks液內(nèi),置冰浴中。

⑶ 脾細胞用白細胞計數(shù)法計數(shù)并用臺盼藍檢查活細胞的百分率。脾細胞制成5~10×107細胞/ml;另取少量脾細胞懸液與等量0.5%臺盼藍混勻,靜置數(shù)分鐘,計數(shù)核被染色死細胞的百分數(shù),從總細胞數(shù)中將死細胞數(shù)扣除。

 5.試驗平皿的制備   將底層平皿和所有試劑(除脾細胞外)預(yù)溫40℃左右。于水浴內(nèi)保溫之表層基中加入以下各試劑:⑴胎牛血清0.1ml;⑵右旋糖酐(10mg/m1)0.1ml(用瓊脂糖時不用此試劑);⑶20%SRBC懸液0.1ml;⑷脾細胞懸液(5~l0×106細胞/m1)0.1ml。迅速將小試管夾于兩手掌間旋轉(zhuǎn)混勻,傾注于鋪有底層之平皿內(nèi),避免傾入氣泡。在水平臺上使表層基鋪平,凝固后,放37℃孵育1h。然后于每個平皿內(nèi)加1∶l0稀釋的補體1.5~2ml,使均勻覆蓋其表面,再次孵育30min,即可用肉眼或放大鏡觀察溶血空斑,并計數(shù)。

   【結(jié)果】  

將平皿劃分小格,用放大鏡觀察并計數(shù)溶血空斑總數(shù),再換算出每百萬脾細胞中所含抗體形成細胞數(shù)。如用于藥物篩選,可比較給藥組和對照組每百萬脾細胞(1×106)中抗體形成細胞數(shù)的平均值,以表示藥物的刺激作用或抑制作用。

注意事項

1.綿羊紅細胞最好用新鮮脫纖維的SRBC。洗滌SRBC時,離心速度以2000rpm,10min為宜,不超過三次。用前鏡檢如有變形,表示脆性增大,不宜采用。

2.SRBC可大致計數(shù),但脾細胞計數(shù)必須準(zhǔn)確。

3.免疫動物必須用純系動物,雜種動物個體差異大,難以比較。最好先作幾次預(yù)試驗,使每個平皿空斑數(shù)控制在100~150個左右為宜。

4.補體濃度以l∶10為宜,無需經(jīng)過滴定。但若用瓊脂鋪板時則補體原液不必稀釋,以阻止瓊脂的抗補體作用。

5.所有器皿和各種試劑在加入表層基前均需預(yù)溫,并在水平臺上操作。

6.離體的脾細胞應(yīng)不離冰浴,防止細胞死亡。

思考題

1.簡述溶血空斑試驗的原理及其實際應(yīng)用。

2.在本試驗中,綿羊紅細胞有什么作用? 

實驗四  生物制品

用于人工免疫的抗原、免疫血清、免疫細胞和免疫分子制劑,以及診斷用的生物制劑統(tǒng)稱為生物制品(biologic product)。生物制品主要分為三類,即預(yù)防接種制品、治療制品和診斷用品。

一、預(yù)防接種制品

   國內(nèi)常將由細菌、螺旋體制備的用于人工自動免疫的生物制品稱為菌苗,而將由病毒、立克次體等制備的用于人工自動免疫的生物制品稱為疫苗。國際上常將其統(tǒng)稱為疫苗。

(一) 菌苗類

1.死菌苗  霍亂菌苗、傷寒菌苗,傷寒、副傷寒甲、乙三聯(lián)菌苗,霍亂、傷寒、副傷寒甲、乙四聯(lián)菌苗,百日咳菌苗等。

2.活菌苗  卡介苗(BCG)、鼠疫活菌苗。

  (二)疫苗類

1.死疫苗  流行性乙型腦炎鼠腦疫苗、雞胚疫苗、組織培養(yǎng)疫苗、斑疹傷寒鼠肺疫苗。

2.活疫苗  脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗。

3.類毒素類

由細菌外毒素制備的人工自動免疫制品稱為類毒素,如白喉類毒素、精制磷酸鋁吸附白喉類毒素、傷風(fēng)類毒素、精制磷酸鋁吸附破傷風(fēng)類毒素等。

4.混合制品類

百日咳菌苗和白喉類毒素混合制品,百日咳菌苗、白喉、破傷風(fēng)類毒素混合制品。

二、治療制品

  (一)抗毒素

用類毒素免疫動物獲得的人工被動免疫制品稱為抗毒素。如精制白喉抗毒素、精制破傷風(fēng)抗毒素、干燥粉劑破傷風(fēng)抗毒素。

  (二)其它免疫血清制品

胎盤球蛋白、丙種球蛋白、抗麻疹人血清、抗淋巴細胞血清(anti-lymphocyteserum, ALS)、 抗淋巴細胞丙種球蛋白(anti-lymphocyte γ globulin, ALG)等。

  (三)免疫細胞和免疫分子制劑

轉(zhuǎn)移因子(transfer factor,TF)、免疫核糖核酸(immune RNA,iRNA)、胸腺素(thymosin)等。

三、診斷用品

  (一)舊結(jié)核菌素(old tuberculin,OT)和精制結(jié)核蛋白衍生物(purified protein der中國衛(wèi)生人才網(wǎng)ivative,PPD)。

  (二)錫克氏毒素(Schick’s toxin)、狄克氏毒素(Dick’s toxin)。

  (三)診斷菌液  變形桿菌OX19、OXK 等菌液。

  (四)診斷血清  沙門氏菌屬因子血清,志賀氏菌屬因子血清,甲胎蛋白診斷血清,羊抗人IgG、IgA、IgM診斷血清等。

思考題

1.常用于預(yù)防接種和免疫治療的生物制品有哪些?其應(yīng)用原理與原則如何?

2.什么是人工主動免疫和人工被動免疫?

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