目前國內(nèi)冰凍紅細胞常規(guī)解凍去甘油的方法多為手工制備，制備過程復雜，不易操作，常常由于人為原因?qū)е录t細胞制品的質(zhì)量極不穩(wěn)定(融化后的紅細胞回收率只有60％左右)，進而影響療效，甚至引起病人嚴重的輸血不良反應。為了及時向臨床提供Rh陰性血液，本中心于2005年4月開展了Rh陰性血液深低溫保存，利用Mll5紅細胞洗滌系統(tǒng)對凍存的Rh陰性紅細胞進行解凍去甘油洗滌，通過1年的實踐，終于制備出各項指標均達到國家規(guī)定質(zhì)量標準的解凍紅細胞，并已用于臨床，輸入效果良好。筆者對33U冰凍解凍去甘油紅細胞進行了質(zhì)量檢測，現(xiàn)將質(zhì)控及制備方法報告如下。
1 材料與醫(yī)學全在線方法
1．1 儀器設備
CA 620全自動血細胞分析儀(瑞士MEDONIK)，722型分光光皮儀(上海第三儀器制造廠)，CR7離心機(日本HITACHI)，-80℃專用冰箱(美國)，無菌接口機(日本TERUMO)，M115洗滌系統(tǒng)(美國)。
1．2 方法
制備冰凍紅細胞采用慢速冷凍法，用4℃保存6天內(nèi)的Rh陰性全血或懸浮紅細胞離心除去血漿的紅細胞中加入57.1％(g／v)甘油為主要成分的紅細胞冷凍保護劑，待紅細胞甘油化后于-80℃專用冰箱冷凍保存，7天～350天后于39℃水浴解凍，參考美固FDA推薦方法并適當改進：第一次稀釋：向血袋內(nèi)注入9％NaCI溶液50ml，平衡2min；第二次稀釋：向血袋注入0．9％ NaCl 溶液100 ml，平衡2min；第三次稀釋：向血袋注入0．9％NaCl溶液150 ml，平衡2min。然后，用M115型紅細胞洗滌系統(tǒng)洗滌：注入0．9％NaC1溶液連續(xù)洗滌，當洗滌液顏色與制造商所提供的比色卡上“2”相當時洗滌完成。洗滌后用0．9％NaCl溶液懸浮紅細胞。
1．3 質(zhì)量檢測
用血細胞分析儀檢測紅細胞、血紅蛋白含量及洗滌前白細胞、血小板；Nageotte板檢測洗滌后的白細胞數(shù)；細胞計數(shù)板檢測洗滌后血小板；鄰甲聯(lián)苯胺法檢測冰凍解凍去甘油紅細胞上清液游離血紅蛋白含量及體外溶血試驗；采用磷酸甘油氧化酶 - 過氧化物酶(GPO—POD)法測定殘余甘油含量。
2 結(jié)果
2．1 33袋冰凍解凍去甘油紅細胞在光鏡下觀察細胞膜完整，表面呈現(xiàn)雙凹狀，無團聚現(xiàn)象。
2．2 紅細胞回收率(％)80．24±6．19，甘油含量(g/L)3．79±0．88，游離血紅蛋白(g/L)0．71±0．23，解凍紅細胞體外溶血(％)21．66±11．2，見表1。
表1 33U冰凍解凍去甘油紅細胞的質(zhì)控結(jié)果
| 質(zhì)量標準 | ||
| 洗滌前Hb（g/L) | 119±10.5 | |
| 洗滌后Hb（g/L) | 110±9.7 | |
| 紅細胞回收率（%) | 80.24±6.19 | ≥80% |
| 殘余甘油含量（g/L) | 3.79±0.88 | ≤10g/L |
| 游離Hb（g/L) | 0.71±0.23 | ≤1g/L |
| 體外溶血（%) | 21.66±11.2 | ≤50% |
| 殘余白細胞（%) | 0.9 | ≤1% |
| 殘余血小板（%) | 0.5 | ≤1% |
3 討論
Rh陰性血型在漢族人群中僅占2‰ 一5％，而血液常規(guī)保存有效期只有21—35天，因此，采集到的血液常因臨床無需要而造成浪費，另一方面，臨床緊急需要時，也可能因庫存不足或偏型而造成供血困難，甚至延誤臨床急癥搶救時間。所以，Rh陰性血液的深低溫長期保存，對于血源、血液采集和供血的及時合理調(diào)配尤為重要。
根據(jù)質(zhì)控結(jié)果，這些數(shù)據(jù)表明，利用Mll5紅細胞洗滌系統(tǒng)，洗滌冰凍紅細胞的方法是可行的，但需進一步改進以最大程度地減少紅細胞的丟失。
影響紅細胞回收率的原因分析：
紅細胞甘油化是整個冷凍實驗的關(guān)鍵。細胞對滲透壓改變十分敏感，為使細胞承受能力在滲透壓變化范圍之內(nèi)，就一定要掌握好甘油的注入速度。細胞充分甘油化后需要平衡一段時間，但時間延長會增加溶血，建議甘油化細胞平衡30分鐘內(nèi)凍存。與quanxiangyun.cn冰凍紅細胞融化解凍的方法有關(guān)。我們認為融化冰凍紅細胞的溫度時間是關(guān)鍵，融化時水溫過低，可再度形成冰晶，將會刺破紅細胞膜而溶血，融化時水溫過高時間過長可使紅細胞膜的表面張力過度增高、破裂而溶血，我們認為融化冰凍紅細胞的溫度控制在39℃，時間不超過20分鐘。與洗滌去甘油前加高滲鹽的濃度有關(guān)。由于冰凍紅細胞在融化后，紅細胞處于高滲狀態(tài)，所以必須先加入9％氯化鈉溶液，使紅細胞膜內(nèi)外的滲透壓達到平衡，再分兩次加入0．9％氯化鈉溶液，使紅細胞膜內(nèi)的滲透壓由高滲呈梯度逐漸過渡到等滲后，再進行循環(huán)洗滌去甘油。通過實驗說明該技術(shù)已完成Rh陰性稀有血液的保存以及解凍，并基本解決了本地區(qū)Rh陰性血液需求緊張的狀況。
