（四)DNA探針標(biāo)記常用試劑的配制
�。�1)10 ×缺口平移緩沖液：200mmol/l Tris-HCl,pH7.4含50mmol/L MgCl2;100mmol/Lβ-巰基乙醇、1mg/ml BSA。
（2)缺口平移反應(yīng)終止液：200mmol/L NaCl;10mmol/l Tris-HCl,pH7.4; 11mmol/L EDTA; 0.5% SDS。
�。�3)DNaseⅠ:干粉狀DNaseⅠ(2000～3000u/mg)溶于20mmol/l Tris-HCl, pH7.5中（1mg/ml),10μl分裝，-20℃保存一年。
�。�4)10×DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段)緩沖液：500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L Mg－Cl2;10mmol/L DTT;0.5mg BSA。
�。�5)10×激酶緩沖液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4,50mmol/L MgCl2;20mmol/L DTT; 1.0mmol/L亞精胺。
（6)10×隨機(jī)引物標(biāo)記緩沖液；500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L MgCl2;10mmol/L β-巰基乙醇；500μg/ml BSA。
�。�7)1×加尾緩沖液：100mmol/L二甲胂化鉀，pH7.0,1mmol/l CoCl2 0.2mmol/L DTT。
�。�8)1mol/L MgCl2:MgCl2 47.60g溶于500ml水中，100ml分裝，高壓滅菌，室溫保存。
（9)0.25mol/L EDTA(Ph8.0):EDTA 52.02g溶于400ml水中，調(diào)pH至8.0，加水至500ml，100ml分裝，高壓滅菌，室溫保存。
（10)4mol/L醋酸鈉：取無水醋酸鈉82g溶于200ml水中，用醋酸調(diào)pH至6.5，加水至250ml，高壓滅菌，或0.45μm膜過濾，室溫保存。
�。�11)10% SDS：10g SDS（十二烷基硫酸鈉)溶于50ml水中，加水至100ml，分裝后室溫保存。
�。�12)20×SSC：取NaCl 175.3g;檸檬酸鈉88.2g;加水至1000ml，用10mol/l NaOH調(diào)pH至7.0；高壓滅菌，室溫保存。
�。�13)無菌水：100ml去離子水或雙蒸水，分裝，高壓滅菌，室溫保存，開瓶后僅限一周使用。
（14)10×激酶緩沖液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4;100mmol/L MgCl2;50mmol/l DTT;10mmol/L亞精胺（非必需)。
�。�15)T4多聚核苷酸激酶：10u/μl，保存在甘油中，-20℃。
（16)TE緩沖液（Tris/EDTA)：Tris,10mmol/l pH7.4(0.5ml 2mol/L貯存液)，1.0mmol/l ED－TA,pH8.0(20μl 0.5mol/L)貯存液，加水至100ml，室溫保存。
�。�17)2mol/L Tris-HCl pH7.4:Tris242.2g溶于850ml，加濃HCl 75ml ,邊加邊緩慢攪動，至pH7.4,于加水至1000ml。
�。�18)1mol/L DTT(二硫蘇糖醇)：3.0g DTT溶于20ml水中，分裝，于-20℃貯存。
�。�19)0.5mol/L EDTA（乙二胺四乙酸二鈉鹽)：在燒杯中先加入300ml水，加入93.5g EDTA－Na2·2H2O,充分混勻，加10mol/l NaOH調(diào)pH至8.0,加水至500ml。
�。�20)10mol/L NaOH：200g NaOH溶于450ml水中，混勻，再加水至500ml。
�。�21)5mol/L NaCl：292.25g NaCl,加水至1000ml。
�。�22)1mol/L HCl：加86.2ml濃鹽酸至913.8ml水中。
（23)1mol/L CaCl2：147g CaCl2：2H2O,溶于1000ml水中,高壓滅菌,室溫保存。
三、固定劑
進(jìn)行原位雜交的組織或細(xì)胞標(biāo)本常需經(jīng)固定處理。盡管許多化學(xué)物質(zhì)對組織/細(xì)胞有固定作用，但核酸原位雜交的理想固定液應(yīng)具備如下特點(diǎn)：①能很好地保持組織細(xì)胞的狀態(tài)；②對核酸無抽提、修飾及降解作用；③不改變被檢核酸分子在組織細(xì)胞內(nèi)的定位；④對核酸及探針的雜交過程無阻礙作用；⑤固定液本身對雜交信號無遮蔽、掩蓋作用，如不使本底增加等；⑥理化性質(zhì)穩(wěn)定、價格低廉。
1．4%多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFA)
配法：稱取40g PFA溶于裝有500ml DEPC水的玻璃容器（燒杯或燒瓶)中，持續(xù)加熱磁力攪拌至60～65℃，使成乳白色懸液。用1.0mol/L的NaOH值至7.0，使呈清亮狀（滴加)，再加入約500ml 2×PBS※，充分混勻（在冰浴或冷水浴中)，可再檢測一下pH，過濾后定容至1000ml，室溫或4℃保存?zhèn)溆谩?/P>
注意：①配制時應(yīng)在通風(fēng)條件下操作，并避免接觸皮膚和吸入（戴手套及口罩)，因PFA有較強(qiáng)的固定作用及毒性，對粘膜及皮膚有固定及毒性，刺激作用；②加熱時，溫度不宜過高，常為60～65℃，否則，PFA降解失效；③配制好的PFA雖可存放一定時間，但過久的液體，固定效果下降，建議盡早使用。
附：固定液用PBS的配制：
配法：按上述比例稱取試劑，溶于DEPC水（也可用蒸餾水加DEPC)500～800ml中，過濾后，加水定容至1000ml，高壓滅菌。通常配制成10×PBS的儲備液，2×PBS和1×PBS可用DEPC水稀釋獲得。
除用DEPC水配制PFA外，也有用滅菌蒸餾水或經(jīng)DEPC處理的0.01～0.1mol/L的PBS配制的，方法及注意事項(xiàng)同上。
4% PFA是目前原位雜交組織化學(xué)技術(shù)中最常用的固定液，它能較好地保持組織及細(xì)胞內(nèi)的RNA，同時對形態(tài)保持也較好。通常組織塊固定4～12h，載片固定時間在10～15min以內(nèi)，RNA含量較為恒定。過度延長固定時間會引起細(xì)胞內(nèi)生物大分子的過度交聯(lián)，影響探針的穿透力，降低雜交效率。
2．甲醛
�、�10%甲醛（Formaldehyde,FA)
量取二者充分混合而可。較適于檢測RNA的組織及細(xì)胞固定，也可用于新鮮冰片切片后固定。
�、�10%福爾馬林試劑：
較適于固定細(xì)胞。
③10%中性福爾馬林
市售甲醛 100ml
Na2HPO4 4g
NaH2PO4 6.5g
DEPC水 ～1000ml
常用于石蠟樣品切片的固定。
10%的甲醛由于有促進(jìn)DNA雙鏈分子交聯(lián)的作用，干擾DNA變性，故不適于DNA雜交。在組織或細(xì)胞原位雜交中，可通過使用含50%甲酰胺的雜交液使DNA變性解鏈而解決。這類固定液在DNA/RNA雜交中有較好的效果。
3．4%戊二醛效果較40%差。
4．0.1%戊二醛常用于固定組織，適于新鮮組織冰凍切片及石蠟切片的后固定，常用于檢測DNA的原位組織雜交方法。
5．乙醇/醋酸（或冰醋酸)將乙醇與醋酸按3：1的體積比充分混合即可。該液較適于固定細(xì)胞的原位雜交，尤其檢測DNA時。
乙醇/醋酸雖廣泛應(yīng)用于原位雜交中，但RNA保留較差，可本底很低，即背景染色淡。
6．甲醇/醋酸（3：1)用前按體積比3：1比例充分混合即可。
7．甲醇/丙酮（1：1)適于培養(yǎng)細(xì)胞的原位雜交技術(shù)。
8．4%多聚甲醇-0.5%～1%戊二醛溶液在pH7.4磷酸緩沖液中，用于免疫電鏡樣品固定。
