抗體的制備

　�。�2)顆�？乖�免疫性強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細(xì)胞性抗原為例，免疫時要求抗原量為1～2×107個細(xì)胞。

　　初次免疫 1×107/0.5ml ip

　　↓2～3周后

　　第二次免疫 1×107/0.5ml ip

　　↓3周后

　　加強(qiáng)免疫（融合前三天)1×107/0.5ml ip或iv

　　↓

　　取脾融合

　�。ǘ�)細(xì)胞融合

　　1．細(xì)胞融合前準(zhǔn)備

　�。�1)骨髓瘤細(xì)胞系的選擇：骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb。常用的骨髓瘤細(xì)胞系見表2-4。

表2-4用于融合試驗(yàn)的主要骨髓瘤細(xì)胞系

　　骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)可用一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10%～20%，細(xì)胞濃度以104～5×105/ml為宜，最大濃度不得超過106/ml。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長的中期時，可按1：3～1：10的比例傳代。每3～5天傳代一次。細(xì)胞在傳代過程中，部分細(xì)胞可能有返祖現(xiàn)象，應(yīng)定期用8-氮鳥嘌呤進(jìn)行處理，使生存的細(xì)胞對HAT呈均一的敏感性。

　�。�2)飼養(yǎng)細(xì)胞：在組織培養(yǎng)中，單個或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長繁殖，若加入其它活細(xì)胞，則可促進(jìn)這些細(xì)胞生長繁殖，所加入的這種細(xì)胞數(shù)被稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。在制備McAb的過程中，許多環(huán)節(jié)　需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（較為常用)、小鼠脾臟細(xì)胞或胸腺細(xì)胞。也有人用小鼠成纖維細(xì)胞系3T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞的量為一般為2×104或105細(xì)胞/孔。

　　2．細(xì)胞融合的步驟

　　（1)制備飼養(yǎng)細(xì)胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。

　　與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周齡

　　↓

　　拉頸 處死，浸泡在75%酒精內(nèi)，3～5min

　　↓

　　用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜

　　↓

　　用無菌注射器注入5～6ml預(yù)冷的培養(yǎng)液（嚴(yán)禁刺破腸管)

　　↓

　　反復(fù)沖洗，吸出沖洗液

　　↓

　　沖洗液放入10ml離心管，1200rpm/分離5～6min

　　↓

　　用20%小牛血清（NCS)或胎牛血清（FCS)的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×105/ml

　　↓

　　加入96孔板，100μl/孔

　　↓

　　放入37。c CO2孵箱培養(yǎng)

　　（2)制備免疫脾細(xì)胞

　　最后一次加強(qiáng)免疫3天后小鼠拉頸處死

　　↓

　　無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗 一次

　　↓

　　脾臟研碎，過不銹鋼篩網(wǎng)

　　↓

　　離心，細(xì)胞用培養(yǎng)液洗2次

　　↓

　　計(jì)數(shù)

　　↓

　　取108脾淋巴細(xì)胞懸液備用

　　（3)制備骨髓瘤細(xì)胞

　　取對數(shù)生長骨髓瘤細(xì)胞離心

　　↓

　　用無血清培養(yǎng)液洗2次

　　↓

　　計(jì)數(shù)，取得×107細(xì)胞備用

　�。�4)融合

　　①將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養(yǎng)液洗1次，離心，1200rpm,8min;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG)濃度。輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略松動。

　�、�90s內(nèi)加入37℃預(yù)溫的1ml 45%PEG（分子量4000)溶液，邊加邊輕微搖動。37℃水浴作用90s。

　�、奂�37。C預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。

　�、茈x心，800rpm, 6min。

　�、莩渖锨澹�用含20%小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液重懸。

　　⑥將上述細(xì)胞，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔板內(nèi)，每孔加100μl。一般一個免疫脾臟可接種4塊96孔板。

　�、邔⑴囵B(yǎng)板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

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