當細胞的基因組DNA用特定的內(nèi)切酶如Eco RⅠ切割時，凡有GAATTC的地方都被切開，得到許多長度一定但互不相等的片段，需要分析、分離的基因或DNA片段就在其中某一特定的的片段上。
然而許多長短不同的DNA片段混合在一起是很難分析的。因此首先必需將它們按大�。ㄩL短)分離開來，這可借助凝膠電泳來完成。在電泳時，分子量愈小的片段的遷移愈快，愈大的片段愈慢。因此，在電泳結束時可以獲得一個由大到小連續(xù)的帶譜（smear)，而由許多細胞基因組得來的某一特定片段，因其長度相同將處于同一位置，有利于檢出。但凝膠易碎且操作不便。英國科學家Southern首創(chuàng)印跡法克服了上述困難（圖13－6)。
一、Southern印跡法（Southern blot)
基本原理是：硝酸纖維膜或尼龍濾膜對單鏈DNA的吸附能力很強，當電泳后凝膠經(jīng)過DNA變性處理，覆以上述濾膜，再于其上方壓上多層干燥的吸水紙，借助它對深鹽溶液的上吸作用，凝膠上的單鏈DNA將轉移到濾膜上。轉移是原位的，即DNA片段的位置保持不變。轉移結束后，經(jīng)過80℃烘烤的DNA，將原位地固定于膜上。
圖13－6 Southern印跡雜交示意圖
當含有特定基因片段已原位轉移到膜上后，即可與同位素標記了的探針進行雜交，并將雜交的信號顯示出來。雜交通常在塑料袋中進行，袋內(nèi)放置上述雜交濾膜，加入含有變性后探針的雜交溶液后，在一定溫度下讓單鏈探針DNA與固定于膜上的單鏈基因DNA分子按堿基到互補原理充分結合。結合是特異的，例如只有β珠蛋白基因DNA才能結合上β珠蛋白的探針。雜交后，洗去膜上的未組合的探針，將Ⅹ線膠片覆于膜上，在暗盒中日光進行放射自顯影。結合了同位素標記探針的DNA片段所在部位將顯示黑色的雜交帶，基因的缺失或突變則可能導致帶的缺失或位置改變。
分子雜交是基因探測的基礎，除了用印跡雜交外，還有斑點雜交法。即將DNA樣品變性后直接點在硝酸纖維濾膜上，再與探針雜交，或者將細胞或病毒點在膜上，菌落或菌斑原位地吸附在膜上，經(jīng)過變性處理，再進行雜交。斑點雜交多用于病原體基因，如微生物的基因，但也可用于檢查人類基因組中的DNA序列。
二、聚合酶鏈反應
近年來，基因分析和基因工程技術有了革命性的突破，這主要歸功于聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR)的發(fā)展和應用。應用PCR技術可以使特定的基因或DNA片段在短短的2－3小時內(nèi)體外擴增數(shù)十萬至百萬倍。擴增的片段可以直接通過電泳觀察，也可用于進一步的分析。這樣，少量的單拷貝基因不需通過同位素提高其敏感性來觀察，而通過擴增至百萬倍后直接觀察到，而且原先需要一、二周才能作出的診斷可以縮短至數(shù)小時。PCR反應的原理如圖13－7。
圖13－7 PCR原理示意圖黑色線代表引物
由圖可見，首先應按照欲檢測的DNA的5’和3’端的堿基順序各合成一段長約17－20余個堿基的寡核苷酸作為引物（primer)，其次是將待檢測的DNA變性后，加入四種單核苷酸（dNTP)、引物和耐熱聚合酶。在較低的溫度，引物將與待擴增的DNA鏈復性結合，然后的聚合酶的作用下，利用溶液中的核苷酸原料，不斷延伸合成新互補鏈，這樣，一條DNA雙鏈就變成了兩條雙鏈。若繼續(xù)按照變性（92－95℃)→復性（40－60℃)→引物延伸（65－72℃)的順序循環(huán)20至40個周期，就可以得到大量的DNA片段。理論上循環(huán)20周期可使DNA擴增2n，即100余萬倍。PCR反應特異性強，靈敏度高，極微量的DNA即可作為擴增的模板得到大量的擴增片段。毛發(fā)、血痕，甚至單個細胞的DNA即可供PCR擴增之用。因此它用于病原體DNA的檢查、腫瘤殘留細胞的檢出、罪犯或個體遺傳物質(zhì)的鑒定以及遺傳病的基因診斷等。
目前已可對一系列的遺傳病進行PCR診斷。如果疾病是由基因缺失引起的（如α地貧)，則在缺失兩端設計一對引物進行擴增，就不會得到擴增產(chǎn)物或只能得到縮短了的擴增產(chǎn)物。如果疾病是由點突變引起的，而突變的位置和性質(zhì)已知，則在設計引物時使之包括突變部位，由于突變后的堿基不配對，結果無擴增片段；或者在引物設計時于其3’端設計一個錯誤的核苷酸，使之與突變了的核苷酸配對，其結果是正常引物不能擴增，而用錯誤的引物能擴增，從而可對突變的存在作出判斷。
PCR技術目前有許多新的發(fā)展，用途日益擴大。例如，可用RNA為模板經(jīng)過逆轉錄再行擴增的RT－PCR；改變兩引物濃度，使其相差100倍，結果得到大量單鏈產(chǎn)物，稱為不對稱PCR，其單鏈產(chǎn)物可用于序列分析；在一個反應中加入多對引物同時檢測多個部位的多重PCR等等。
三、擴增片段長度多態(tài)性
小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA的長度多態(tài)性可以通過PCR擴增后電泳來檢出，并用于致病基因的連鎖分析，這種診斷方法稱為擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP)連鎖分析法。PCR擴增后，產(chǎn)物即等位片段之間的差別有時只有幾個核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離鑒定。此法多用于突變性質(zhì)不明的連鎖分析.
四、等位基因的特異寡核苷酸探針診斷法
當基因的突變部位和性質(zhì)已完全明了時，可以合成等基因特異的寡核苷酸探針（allele-specific oligonucleotide,ASO)用同位素或非同位素標記進行診斷。探針通常為長20bp左右的核苷酸。用于探測點突變時一般需要合成兩種探針，一種與正�；蛐蛄型耆恢拢芘c之穩(wěn)定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩(wěn)定雜交，但不能與正�；蛐蛄蟹�(wěn)定雜交，這樣，就可以把只有一個堿基發(fā)生了突變的基因區(qū)別開來.
PCR可結合ASO，即PCR－ASO技術，即先將含有突變點的基因有關片段進行體外擴增，然后再與ASO探針作點雜交，這樣大大簡化了方法，節(jié)約了時間，而且只要極少量的基因組DNA就可進行。
五、單鏈構象多態(tài)性診斷法
單鏈構象多態(tài)性（signle strand conformation polymorphism,SSCP)是指單鏈DNA由于堿基序列的不同可引起構象差異，這種差異將造成相同或相近長度的單鏈DNA電泳遷移率不同，從而可用于DNA中單個堿基的替代、微小的缺失或手稿的檢測。用SSCP法檢查基因突變時，通常在疑有突變的DNA片段附近設計一對引物進行PCR擴增，然后將擴增物用甲酰胺等變性，并在聚丙烯酰胺凝膠中電泳，突變所引起的DNA構象差異將表現(xiàn)為電泳帶位置的差異，從而可據(jù)之作出診斷。
PCR－SSCP法具有能快速、靈敏地檢測有無點突變或多態(tài)性的優(yōu)點，但如欲闡明突變的堿基性質(zhì)，則需作序列分析。
