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（2）連續(xù)測定法
1）紫外-可見分光光度法：這是根據(jù)產(chǎn)物和底物在某一波長或波段上，有明顯的特征吸收差別而建立起來的連續(xù)檢測方法。
吸收度測定應用的范圍很廣，幾乎所有氧化還原酶都可用此法測定。例如，脫氫酶的輔酶NAD（P）H在340nm有吸收高峰，而其氧化型則無；細胞色素氧化酶的底物為細胞色素C，該物質(zhì)在還原態(tài)時，在550nm的摩爾吸收系數(shù)為2.18×104，而氧化型為0.80×104，故可利用這種吸收度差別來進行測定。
吸收度測定法的特點是靈敏度高（可檢測到10－9摩爾水平的變化）、簡便易行，測定一般可在較短的時間內(nèi)完成。
2）熒光分析法：它的原理是，如果酶反應的底物與產(chǎn)物之一具有熒光，那么熒光變化的速度可代表酶反應速度。
應用此法測定的酶反應有兩類：一是脫氫酶等反應，它們的底物本身在酶反應過程中有熒光變化，例如NAD（P）H的中性溶液發(fā)強的藍白色熒光（460nm），而NAD（P）＋則無。另一類是利用熒光源底物的酶反應，例如可用二丁酰熒光素測定脂肪酶，二丁酰熒光素不發(fā)熒光，但水解后釋放熒光素。熒光分析法測得的酶活性水平通常以單位時間內(nèi)熒光強度的變化（AF／At）表示。熒光測定法的主要缺點是，熒光讀數(shù)與濃度間沒有確切的比例關(guān)系，而且常因測定條件如溫度、散射、儀器等而不同，所以如果要將酶活性以確定的單位表示時，首先要制備校正曲線，根據(jù)這曲線再進行定量。
熒光分析法的優(yōu)點是靈敏度極高，它比光吸收測定法還要高2～3個數(shù)量級，因此特別適于酶量或底物量極低時的快速分析。
3）旋光度法：某些酶反應過程常伴隨著旋光變化，在沒有其它更好的方法可用時，可考慮用旋光度測定法。
4）酶偶聯(lián)測定法：所謂酶偶聯(lián)法是應用過量、高度專一的“偶聯(lián)工具酶”，使被測酶反應能繼續(xù)進行到某一可直接、連續(xù)、簡便、準確測定階段的方法。以和光學檢測法相偶聯(lián)的分析法為例：
①被測酶反應的產(chǎn)物是某脫氫酶的底物。在這種情況下，可向反應測定系統(tǒng)中加入足夠量的相應的脫氫酶和輔酶，使反應繼續(xù)進行，然后通過NAD（P）H特征吸收變化而加以測定。例如，己糖激酶（HK）的測定就可在過量的葡萄糖－6－磷酸（G-6-P）脫氫酶�。℅6PDH）和NADP＋存在的條件下進行：
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大約有50種左右的脫氫酶可以利用NAD＋和NADH，20多種脫氫酶能利用NADP+和NADPH用作偶聯(lián)指示酶。
有些情況下，被測反應不能直接和上述脫氫酶反應連起來，此時可再插入一個起聯(lián)結(jié)作用的輔助酶反應。例如為了測定肌激酶就可用這樣的系統(tǒng)：
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其中PEP、Pry和L分別代表磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸和乳酸；AMP、ADP和ATP分別為一磷酸、二磷酸和三磷酸腺苷。
②被測反應物和其他有光學性質(zhì)改變的酶反應偶聯(lián)。 如腺苷酸脫氨酶在催化AMP脫氨過程中對265nm的光伴隨有吸收度的降低，此酶專一于AMP，不作用ADP和ATP，因此在測定某些合成酶或激酶反應時，它可用作偶聯(lián)指示酶；肌激酶的測定也可被利用：
應用酶偶聯(lián)測定法最重要的是加入的偶聯(lián)工具酶應該高度純凈、專一而且過量，使測得的反應速度和酶濃度間有線性關(guān)系。至于偶聯(lián)指示 酶的用量一般應為被測酶的100倍左右。
5）其他：其他檢測法有電化學測定法；離子選擇性電極測定法適用于產(chǎn)酸反應中pH變化的測定；放射化學法的特點是靈敏度極高，可直接用于酶活性測定，缺點是操作繁而費時。
4．測定過程中應注意的問題
�。�1）產(chǎn)物的測定：和一般化學反應一樣，酶反應速度可用單位時間內(nèi)反應物（底物）的減少或產(chǎn)物的增加來表示：
其中s和p分別代表底物或產(chǎn)物濃度，t為時間。一般情況下，產(chǎn)物和底物的改變量是一致的。但是由于反應系統(tǒng)中使用的底物往往是足夠過量的，而反應時間通常又很短，底物的減少量僅為總量的很小的百分數(shù)，因此測定不易準確；反之，產(chǎn)物從無到有，只要測定方法靈敏，準確度可以很高，故以分析產(chǎn)物為好。
�。�2）反應速度的測定：反應速度可以單位時間內(nèi)底物的變化量表示。如果將測得的產(chǎn)物或底物變化量對時間作圖，可獲得“酶反應進程曲線”，這條曲線的斜率就代表酶反應速度。
大多數(shù)酶的反應進程曲線表明，在酶反應的最初階段里，底物或產(chǎn)物的變化量一般隨反應時間而線性地增加，反應速度恒定；但是反應時間延長，這條曲線會逐漸地彎曲下來，斜率發(fā)生改變，反應速度下降。其原因是，底物濃度在下降，產(chǎn)物在增加，逆反應從無到有逐漸變得顯著起來；同時酸、堿、熱等也在慢慢地使酶失效。因此，這種情況下測得的反應速度已是一種表觀的、多種因素影響下的綜合結(jié)果，不能代表酶的真正活性。真正能代表酶催化活性的是反應初始階段的速度，即反應初速度。
要求得初速度，一般先要給一條酶反應進程曲線，并取其直線線段的斜率代表酶反應初速度；如果這條直線線性不明顯，那末就應沿曲線的最初部分畫出通過零點或外推到零點的切線，并以這條切線構(gòu)成的斜率代表酶反應初速度。
進程曲線可以通過連續(xù)測定得到，也可通過在間隔時間取樣測定繪制，它至少應由三個時間點組成；零時點、適當選擇的時間間隔（取決于具體的反應和測定方法）以及二倍于這個間隔的點。并且要求在這種時間范圍內(nèi)反應量不超過底物總量的20％。
�。�3）測定要達到的要求：酶活力測定的目的，就是要通過酶反應速度的測定，求得酶的濃度或含量，因此，測得的反應速度必須和酶濃度間有線性的比例關(guān)系，這也是檢驗酶反應和測定系統(tǒng)是否適宜、正確的標準。 醫(yī)學全在線網(wǎng)站quanxiangyun.cn
要達到上述測定要求，最基本的是必須測定反應初速度。圖可以很好地說明二者的關(guān)系，（a）是在不同酶濃度條件下得到的反應進程曲線，可見酶濃度不同，反應速度下降的先后、快慢各不相同；如果將這些曲線在不同時間測得的反應速度相對酶濃度作圖，就可得到 �。╞）所示的酶濃度曲線，可見只有在反應時間to測得的反應速度和酶濃度間具有合乎要求的線性比例關(guān)系；而在t1和t2（t2〉t1＞to）得到的結(jié)果則不一定這樣，反應時間越長，這種偏離也越大。
（圖13酶反應進程曲線與酶濃度曲線的關(guān)系）
所以在通常的酶活力測定時，總要先制備兩條曲線：酶反應進程曲線和酶濃度曲線。從前者求得反應初速度，根據(jù)初速度繪制酶濃度曲線，并通過后者來檢驗酶反應測定系統(tǒng)是否適宜。
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