中國幽門螺桿菌研究:胃粘膜檢標本中彎曲菌樣細菌的檢出

1983年Wsrren和Marshall從慢性活動性胃炎患者胃粘膜上皮，發(fā)現有未經鑒定的螺狀彎曲桿菌。此后經起了許多學者的研究�，F在一般認為這是一群與胃部疾患、特別是淺表性胃炎和萎縮性胃炎有密切系的菌種，在許多生物學特性上與已認識的彎曲菌屬很相似，但又有不同，故目前暫稱之為彎曲菌樣為細菌（Campylobacter－like organisms，簡稱CLOs)。我國慢性胃炎發(fā)病率很高，且認為可能與胃癌之發(fā)生有關。本文探討了慢性胃炎胃粘膜活檢中彎曲菌樣細菌的檢出方法，和在各種胃病中的檢出情況。

1　材料及方法

1985年5～7月間，我們對98例有上消化道主訴的患者作內窺鏡檢查，分別作出內窺鏡判斷，并采取活檢本作革蘭染色鏡檢。其中大部分并作了細菌的分離培養(yǎng)。個別標本作了透射電鏡的檢查。內窺鏡每作一次檢查后，均用新潔爾滅消毒清洗。

1.1　光學顯微鏡檢查

取胃粘膜上皮活檢標本，在潔凈玻上涂成約1.5cm×2.0cm的薄膜。自然干燥，加熱固定，革蘭染色后作油鏡檢查。

1.2　透射電子顯微鏡檢查

新鮮活檢標本在pH7.3的含2.0％戊二醛的二甲砷酸鈉中固定2h。用二甲砷酸鈉緩沖液洗2次，在1％四氧化鋨中作后固定。然后包埋，超薄切片，在日立牌H－500電鏡下觀察。

1.3　分離培養(yǎng)

①Skirrow選擇性培養(yǎng)基：以布氏瓊脂作基礎，補充10％羊血，并按下述濃度加入適量抗生素：萬古毒素10mg/L，多粘菌素B2500IU/L，磺胺增效劑5mg/L。②接種和培養(yǎng)方法：取新鮮活檢標本一塊直接涂抹于上述選擇性血瓊脂一角，立即以接種環(huán)劃線分離，并裝入厭氧袋中（不用鈀催化劑)，封口后立即折斷安瓿使枸櫞酸與碳酸氫鈉，硼氫酸鉀產生化學反應，形成適量的CO₂與H₂。然后將盛有培養(yǎng)物的厭氧袋立即送至實驗室。抵達實驗室后即將培養(yǎng)物換入厭氧罐中，將厭氧罐用自制的厭氧培養(yǎng)抽氣換氣裝置抽去90％大氣，再充入80％N₂和10％CO₂（大致相當于實際含O₂2.2％，N₂87.8％，CO₂10％)，置37℃培養(yǎng)3d～4d進行觀察。若細菌不純，作再次分離傳代。

1.4　鑒定試驗

采用目前國內鑒定空腸彎曲菌的一組常規(guī)試驗，包括菌落特征，細菌形態(tài)及染色性，動力，觸酶及氧化酶試驗，用三糖鐵瓊脂、醋酸鋁濾紙條測葡萄糖分解及H2S的產生能力，1％甘氨酸、3.5％NaCl及0.04％TTC的耐受試驗，42℃及室溫生長試驗，萘啶酸、紅毒素、先鋒毒素的藥敏試驗，馬尿酸水解試驗等。具體方法從略。

2　結果

2.1　CLOs的形態(tài)學

胃粘膜活檢標本直拉涂片可見直徑為0.3μm～0.5μmt和長達1.5μm～5.0μm的革蘭染色陰性、弧形、“S”形、或微彎稍直的桿菌。大多大小均一，形態(tài)典型。絕大多數的形態(tài)與空腸彎曲菌相似，少數與胎兒彎曲菌胎兒亞種相似。在空腹采取的胃粘膜活檢標中非常容易識別。在直接涂片中多數CLOs存在于粘液層中，常呈魚貫狀排列。有些菌株革蘭染色下菌體周圍有明顯的空缺，似有莢膜樣結構。細菌的數量多少相差非常懸殊。少至一張涂片上只能找到幾個，多至無法計數。為了大致能反映出活檢標本中菌量的差異，擬訂了一個粗略的定量標準如下：①極少：整個涂片仔細尋找形態(tài)典型的CLOs在5個以下有（本組有11例)。②少許：整個涂片仔細尋找形態(tài)典型的CLOs在5～50個左右（本組有8例)。③＋：密集處一個視野中形態(tài)典型的CLOs不超過5個左右（本組有24例)。④++：密集處一個視野中形態(tài)典型的CLOs達50～500個左右（本組有16例)。⑤+++：密集處一個視野中形quanxiangyun.cn/shouyi/態(tài)典型的CLOs達50～500個左右（本組有8例)。⑥++++：密集處一個野中形態(tài)典型的CLOs＞500，到無法計數（本組有4例)。此外本組98例中僅見雜菌者23例，基本未找到細菌要結構者4例。

由上可見胃粘膜涂片中，71/98或72.2％可找到CLOs，1/4病例僅見雜菌，且大多數雜菌量很少，只少數能打“＋”以上。因雜菌多而CLOs難于識別者僅偶見。盡管在71例CLOs陽性標本中偶而亦可見雜菌，由于CLOs占絕大多數且與雜菌量有明顯差別，所居部位亦不同，再加上CLOs在直接涂片中均有典型的態(tài)特征，因此藉直接涂片識別CLOs并不感到困難。在直接涂片中亦可偶見與革蘭陰性球菌形態(tài)完全不同的圓球狀體結構。經分離培養(yǎng)證實它是CLOs的一種形態(tài)變異，是否系CLOs的細胞壁缺陷型有待探討。這種CLOs的形態(tài)變異具有大小不一、染色不勻、周界較模糊的特征，對有經驗者識別并不困難。

在一例患者十二指腸球部潰瘍和淺表性胃炎者，其胃竇部粘膜在透射電鏡檢查中，可見在緊貼胃粘膜上皮表面處密布著一層外殼滑的CLOs。似乎完全鑲嵌在微絨毛的間隙里，而且排列僅有定向。CLOs幾乎絕大多數呈縱斷面，因此尚能見彎曲菌形態(tài)特征，而在同一病人另一張不同切面的照片中所見都是在粘膜上皮表面排列得整整齊齊的菌體的橫斷面。這種情況似乎與直接鏡檢中所見CLOs在粘液層中排列成錢貫狀相呼應。而且突出的是，與粘膜上皮構成這種致密關系的菌體僅見一層；重疊二層；三層以上者幾乎未見。另外尚可見有7個細菌侵入壁細胞的細胞內小管。Marshall等在電鏡中發(fā)現CLOs具有4～5條帶鞘的鞭毛，他認為這是與只有一條無鞘鞭毛的彎曲菌屬細菌之間的重要區(qū)別，并由此認為CLOs可能屬螺菌屬，而不屬彎曲菌屬。我們在這一活檢標本的一個切面中發(fā)現一條CLOs的一端有兩條清晰的鞭毛另外一些CLOs的末端亦有2～4條鞭毛的斷端。但是Kasper分離到的CLO菌株僅有一根鞭毛。

2.2　CLOs的培養(yǎng)及生化特性

我們對66份活檢標本作了CLOs的分離培養(yǎng)。根據CLOs是一類革蘭陽性在微需氧條件下37℃生長的彎曲菌樣細菌，其生化特片至少有1～2項以上不同于先前已描述的變曲菌屬細菌的特征標準，分離到27株可以定名屬于CLOs的細菌�，F將其主要特征描述如下：①菌落形態(tài)：CLOs在Skirrow培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h出現針尖狀透明無色菌落。72h后發(fā)展成灰白或灰色，隆起或扁平的菌落，直徑＜1min，或稍大，在新鮮培養(yǎng)基上有時可見形成擴散生長的菌落，但多數是互相獨立的，不如空腸彎曲菌那樣易形成透明擴散型水滴樣菌落。部分菌株的菌落有特殊的酸味。②形態(tài)和動力：CLOs在新鮮在培養(yǎng)物中，能見典型的彎曲菌樣形態(tài)，但是與直接涂片鏡檢相比，則菌體稍長而彎曲度較不明是，染色亦有較淡的趨勢，另外在48h以上的培養(yǎng)物中，及條件不適宜的情況下易變成圓球狀結構，須與革蘭陰性球菌區(qū)別。一般革蘭陰性球菌有大小一致、染色較均勻及周界清晰的特點，而CLOs的圓球狀變異則大小很不均一，染色很能不均勻，周界亦較模糊。CLOs在布氏肉湯中在暗視野顯微鏡下可見明顯的動力。運動的形式可見螺旋狀轉動，亦可在原位呈現翻滾運動。③生化和耐受試驗；目前對CLOs尚未形成成套的生化鑒定試驗，我們利用對空腸彎曲菌鑒定常用的一些試驗來測試了解其特性。與彎曲菌樣細菌相仿，觸酶絕大多數是陽性的。另外氧化酶多數陽性，少數陰性。它們普遍不利用糖，因此三糖鐵瓊脂是陰性的，且不變黑。但在醋酸銀濾紙條上可見輕微的黑色，說明能產生微量的H₂s。幾乎絕大多數菌株對1％甘氨酸和0.04％TTC耐受，在3.5％NaCI中不生長。在溫度耐受生長試驗中少數菌株能在42℃生長，室溫（約25℃～35℃)條件下發(fā)現少數菌株能夠生長。馬尿酸水解試驗也是部分陰性，部分陽性。在藥敏試驗中絕大多數對紅毒素敏感，對萘啶酸部分敏感，部分耐藥。對先鋒毒素亦有部分是敏感的，這與空腸彎曲菌明顯不同。

表1　CLOs在各種胃病中檢出情況

2.3　各類胃部疾患的CLOs檢出率

可見淺表性胃炎，淺表一萎縮性胃炎，萎縮性胃炎的陽性檢出率占總陽檢出率的72.5％（表1)。

3　討論

普遍認為，CLOs是一類與彎曲菌屬不同的另一類微生物。因其生長與生化特性與彎曲菌屬有許多不同，DNA的G＋C含量^*與彎曲菌屬亦有不同，而且它們之間不能進行雜交，甚至CLOs不同群之間亦不能進行雜交。故常規(guī)分離培養(yǎng)空腸彎曲菌的方法來分離培養(yǎng)用CLOs，不易取得成功。例如最初我們用Campy－BAP選擇性培養(yǎng)基在42℃下分離培養(yǎng)未取得一例成功。這可能與這類細菌通常只能在37℃下生長而且不少株對先鋒霉素Ⅰ敏感有關。另外由于這類細菌與彎曲菌屬細菌在不能分解糖類和在許多試驗中反應不活躍，又很相似；但在個別菌株的表現型上又各有差異，因之又很不相似。因此企圖完全用傳統(tǒng)的表現型的分解方法得出分群或分型的結論是很困難的。目前除最新報道的個別據認為有價值的試驗（如硝酸鹽還原反應，尿素酶試驗等)外，主要靠DNA的G＋C含量，雜交試驗，及菌體蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠上的電泳譜來鑒別。

胃中酸度比較強，一般細菌難以生存，但CLOs例外，能在胃粘膜上定值。盡管它可能有堿性的粘液保護，但仍然可能具有一定程度的耐酸性。這可從中許多細菌侵犯壁細胞內的泌酸小管得到證明。另外電鏡中顯示粘膜上皮表面只有緊貼的單層CLOs，這可能意味著CLOs與胃粘膜有特殊的親和性，有可能粘膜上皮表面有某種特殊的受體。

由于這類細菌的生長速度較常見的彎曲菌屬細菌為慢，例如空腸彎曲菌在Campy－BAP培養(yǎng)基上42℃24～48h即可見明顯菌落，這類細菌據報道一般需要培養(yǎng)2d～7d，大多在3d～4d形成明顯菌落。我們在2d～4d內觀察結果，這時胃粘膜上的雜菌盡管相對較少，但由于生長較快，在2d～4d觀察結果時可能被雜菌掩蓋了一部分。這類細菌對多種抗生素較敏感，若選用抑制性太強的培養(yǎng)基，則CLOs一起被抑制，若選用抑制性弱的培養(yǎng)基或不加抗生素，則雜菌生長太多難于分離。另外人類的彎曲菌屬的菌株不是都能分離到的。這一點對CLOs來說亦是如此。

注釋^*DNA的G＋C含量：即DNA中鳥呤＋胞嘧淀的含量，是細菌的遺傳學分類依據之一。