本研究旨在制備純化的標(biāo)準(zhǔn)化、商品化抗Hp尿素酶抗體試劑盒,供臨床ELISA檢測用。
1 材料與方法
1.1 試劑盒的制備
Hp尿素酶抗原的分離純化研制:①經(jīng)尿素酶試驗(yàn)選擇尿素酶活性高的經(jīng)系統(tǒng)鑒定的Hp菌株接種于含6%脫纖維綿羊血的布氏平皿中,置微氧環(huán)境,恒溫37℃培養(yǎng)3d收菌,脫洗、稀釋后超聲適度破裂,高速離心取上清液備用。②選用Sephadex G200柱(2.6×75cm柱型)在凝膠過濾成套設(shè)備中從Hp超聲破碎物離心上清液中一次提純Hp尿素酶。③將凝膠過濾后尿素活性峰與相應(yīng)菌全菌蛋白上柱液及離心沉渣SDS-PAGE分析,觀察尿素酶提純效果。④Western blot(免疫印漬)分析:經(jīng)SDS-PAGE將各蛋白分離后,經(jīng)電泳將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上,過渡、洗滌后,放入稀釋的兔抗Hp陽性血清(含抗高分子量菌體相關(guān)蛋白)中,震蕩、洗滌后,浸泡于稀釋后的辣根過氧化酶—葡萄球菌A蛋白液洗滌后將該膜放入新配制的底物顯色液中,震蕩,顯色,清洗,照相。
1.2 試劑盒的臨床應(yīng)用
研究對(duì)象:①病人:診斷按胃鏡及活檢病理確定。同期均檢測Hp抗體。第一階段用全菌抗原(抗Hp抗體)。男741例,女459例,年齡為18歲~77歲(42歲±10歲)。第二階段用商品化試劑盒Hp尿素酶抗原(抗Hp-u抗體)。男1015例,女660例,年齡為16歲~74歲(45歲±7歲)。兩組匹配情況相近。②獻(xiàn)血員:以上兩階段均有健康獻(xiàn)血員同期行Hp抗體檢查,各200例。胃鏡檢查及活檢取材:每例在距幽門5cm周徑內(nèi)的部位鉗取粘膜標(biāo)本分別送檢病理組織學(xué)檢查及Hp培養(yǎng)。組織學(xué)檢查:胃鏡活檢標(biāo)本HE染色組織學(xué)檢查,Giemsa染色確認(rèn)Hp存在。病理診斷參照全國胃癌防治研究協(xié)作組所訂標(biāo)準(zhǔn)。炎癥程度按正常、輕度、中度、重度分別判定為0、1、2、3級(jí)。細(xì)菌培養(yǎng):送檢用的輸送培養(yǎng)基為10%小牛血清布氏肉湯培養(yǎng)基。每試管分裝3ml置入2塊胃鏡活檢組織塊。每例活檢鉗均經(jīng)消毒液浸泡15min后和酒精擦試。Hp培養(yǎng)基用布氏瓊脂培養(yǎng)基為基礎(chǔ)為基礎(chǔ),加入脫纖維羊血及聯(lián)合抗生素、3d后觀察結(jié)果,并作生化鑒定。
以上組織學(xué)與微生物學(xué)檢查結(jié)果獨(dú)立評(píng)價(jià),不受臨床資料暗示影響。血清ELISA法測抗HpIgG和抗HpIgG。流行因素調(diào)查:制定統(tǒng)一調(diào)查表逐項(xiàng)登記。本組共連續(xù)調(diào)查了1200例。藥物治療:212例Hp陽性胃炎患者隨機(jī)分為3組。分別服諾氟沙星和膠體次枸櫞酸鉍(CBS,De—Nol)及安慰劑1個(gè)月。停藥1月后復(fù)查胃鏡及血清抗Hp抗體。
2 結(jié)果
2.1 Hp超聲破碎后
Hp超聲破碎后,高速離心,上清液可經(jīng)SephadexG200柱將Hp尿素酶有效分離。尿素酶活性與脫洗第一峰完全一致,而第一峰中經(jīng)SDS—PAGE檢測只含有30kD及66kD兩條蛋白帶。與Hp尿素酶兩個(gè)亞基的分子量一致,經(jīng)Western blot分析證明第一峰蛋白仍保持了很高的抗原性。
2.2 用提純的Hp尿素酶進(jìn)行血清抗Hp尿素酶抗體測定
用提純的Hp尿素酶進(jìn)行血清抗Hp尿素酶抗體測定,經(jīng)已確定的55份陽性血清標(biāo)本和50份陰性血清標(biāo)本對(duì)照檢測,符合率100%。無假陽性及假陰性。
2.3 對(duì)1675例進(jìn)行抗HpIgG抗體檢測
對(duì)1675例進(jìn)行抗HpIgG抗體檢測。若以培養(yǎng)及(或)組織染色為標(biāo)準(zhǔn),則ELISA敏感性為98%,特異性96%,陽性預(yù)測值為98%,陰性預(yù)測值為96%?笻pIgG抗體半定量結(jié)果,本組檢驗(yàn)以“++”為臨界值標(biāo)準(zhǔn),敏感性可達(dá)98%,特異性達(dá)96%;若以“+”為準(zhǔn),則敏感性雖達(dá)99.1%,但特異性僅為84.9%。
2.4 各種商品試劑盒比較見表1。提示本組試劑盒檢測Hp感染敏感性和特異性均較高。
2.5 各種胃、十二指腸疾病患者血清抗HpIgG抗體檢測情況(見表1)。
2.6 流行因素調(diào)查
流行因素調(diào)查。 本組資料表明以下因素有意義:①Hp感染率隨年齡增長遞增,至60歲達(dá)高峰。②本組肉聯(lián)廠工人(30例)與副食售貨員(菜、肉組)69例抗Hp抗體陽性率分別為90.0%和86.9%,高于其他工種(P<0.01)。③飲食習(xí)慣:喜食涼拌生菜、肉食者Hp感染率高(P<0.05)。④家庭成員中有胃十二指腸疾病者,較無此類病者Hp感染檢出率高(根據(jù)8個(gè)家庭、40名家庭成員統(tǒng)計(jì))。
2.7 ELISA血清Hp抗體檢測用于Hp陽性胃炎抗菌物治療后觀察抗體滴度下降(表2)。
表1 各種商品試劑盒比較
名稱 | 抗原 | 觀察例數(shù) | 敏感性(%) | 特異性(%) | 陽性預(yù)測值(%) | 陰性預(yù)測值(%) |
Pyloriseta | 全菌 | 68 | 68 | 76 | 85 | 62 |
GAP | 全菌 | 64 | 98 | 77 | 86 | 82 |
Helico G | 全菌 | 66 | 82 | 83 | 89 | 74 |
Bio-Rad | 全菌 | 242 | 93.8 | 79.3 | 90 | 87 |
ELA-G | 全菌 | 195 | 92 | 84 | 88 | 90 |
ELA-A | 全菌 | 195 | 80 | 89 | 89 | 79 |
陳振儂b | 尿素酶 | 149 | 92 | 86.5 | 95.4 | 78.1 |
抗Hpb | 全菌 | 1200 | 94.2 | 84.4 | 93.8 | 90.5 |
抗Hpu | 尿素酶 | 1675 | 98 | 96 | 98 | 9www.med126.com6 |
a用乳膠凝集試驗(yàn),余者ELISA測定。b非商品化試劑盒
3 討論
本quanxiangyun.cn/shiti/研究采用ELISA半定量檢測血清抗HpIgG,經(jīng)大宗病例臨床檢測應(yīng)用,敏感性、特異性高、批內(nèi)、批間差異小,穩(wěn)定性強(qiáng),重復(fù)性好。
表2 三組治療前后血清抗Hp滴度 。▁±s)
治療前 | 停藥后 | ||||
1月 | 3月 | 6月 | |||
諾氟沙星 | 700±285 | 176±56b | 165±45b | 168±89b | |
諾氟沙星 | |||||
694±282 | 167±48b | 162±53b | 166±49b | ||
+CBS | |||||
685±286 | 649±282b | 686±278a | 676±282a | ||
安慰劑 |
經(jīng)自身對(duì)照:aP>0.05,bP<0.01
臨床應(yīng)用觀察到,應(yīng)用本試劑盒,在慢性胃炎、消化性潰瘍、非潰瘍性消化不良各類疾病中,抗HpIgG檢測陽性率均很高。尤其在慢性活動(dòng)性胃炎、十二指腸潰瘍中檢出率更高,與文獻(xiàn)報(bào)道一致。Sobala強(qiáng)調(diào)血清學(xué)Hp抗體檢測可用于篩查消化不良,可減少23.3%病例用胃鏡檢查確立Hp感染。本研究也與之相符。
應(yīng)用血清Hp抗體為觀察指標(biāo),來判斷用抗Hp藥物治療根除Hp效果,治療后抗體滴度下降或消失,與近幾年一些報(bào)道一致。本文認(rèn)為,用血清抗HpIgG追訪療效,也可減少患者接受胃鏡復(fù)查Hp根除與否之痛苦?笻pIgG檢測用于流行病學(xué)研究無疑是一重要工具。