呼吸鏈(respiratorychain)是由一系列的遞氫體(hydrogen transfer)和遞電子體(eletron transfer)按一定的順序排列所組成的連續(xù)反應體系,它將代謝物脫下的成對氫原子交給氧生成水,同時有ATP生成。實際上呼吸鏈的作用代表著線粒體最基本的功能,呼吸鏈中的遞氫體和遞電子體就是能傳遞氫原子或電子的載體,由于氫原子可以看作是由H+和e組成的,所以遞氫體也是遞電子體,遞氫體和遞電子體的本質(zhì)是酶、輔酶、輔基或輔因子。
構(gòu)成呼吸鏈的遞氫體和遞電子體主要分為以下五類
為體內(nèi)很多脫氫酶的輔酶,是連接作用物與呼吸鏈的重要環(huán)節(jié),分子中除含尼克酰胺(維生素PP)外,還含有核糖、磷酸及一分子腺苷酸(AMP),其結(jié)構(gòu)如下:
NAD+的主要功能是接受從代謝物上脫下的2H(2H++2e),然后傳給另一傳遞體黃素蛋白。
在生理pH條件下,尼克酰胺中的氮(吡啶氮)為五價的氮,它能可逆地接受電子而成為三價氮,與氮對位的碳也較活潑,能可逆地加氫還原,故可將NAD+視為遞氫體。反應時,NAD+的尼克酰胺部分可接受一個氫原子及一個電子,尚有一個質(zhì)子(H+)留在介質(zhì)中。
此外,亦有不少脫氫酶的輔酶為尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+),又稱輔酶Ⅱ(CoⅡ),它與NAD+不同之處是在腺苷酸部分中核糖的2′位碳上羥基的氫被磷酸基取代而成。
當此類酶催化代謝物脫氫后,其輔酶NADP+接受氫而被還原生成NADPH+H+,它須經(jīng)吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶(pyridine nucleotidetranshydrogenase)作用將還原當量轉(zhuǎn)移給NAD+,然后再經(jīng)呼吸鏈傳遞,但NADPH+H+一般是為合成代謝或羥化反應提供氫。
黃素蛋白種類很多,其輔基有兩種,一種為黃素單核苷酸(FMN),另一種為黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD),兩者均含核黃素(維生素B2),此外FMN尚含一分子磷酸,而FAD則比FMN多含一分子腺苷酸(AMP),其結(jié)構(gòu)如下:
在FAD、FMN分子中的異咯嗪部分可以進行可逆的脫氫加氫反應。
FAD或FMN與酶蛋白部分之間是通過非共價鍵相連,但結(jié)合牢固,因此氧化與還原(即電子的失與得)都在同一個酶蛋白上進行,故黃素核苷酸的氧化還原電位取決于和它們結(jié)合的蛋白質(zhì),所以有關的標準還原電位指的是特定的黃素蛋白,而不是游離的FMN或FAD;在電子轉(zhuǎn)移反應中它們只是在黃素蛋白的活性中心部分,而其本身不能作為作用物或產(chǎn)物,這和NAD+不同,NAD+與酶蛋白結(jié)合疏松,當與某酶蛋白結(jié)合時可以從代謝物接受氫,而被還原為NADH,后者可以游離,再與另一種酶蛋白結(jié)合,釋放氫后又被氧化為NAD+。
多數(shù)黃素蛋白參與呼吸鏈組成,與電子轉(zhuǎn)移有關,如NADH脫氫酶(NADh dehydrogenase)以FMN為輔基,是呼吸鏈的組分之一,介于NADH與其它電子傳遞體之間;琥珀酸脫氫酶,線粒體內(nèi)的甘油磷酸脫氫酶(glycerol phosphate dehydrogenase)的輔基為FAD,它們可直接從作用物轉(zhuǎn)移還原當量H++e reducing equivalent)到呼吸鏈,此外脂肪酰CoA脫氫酶與琥珀酸脫氫酶相似,亦屬于FAD為輔基的黃素蛋白類,也能將還原當量從作用物傳遞進入呼吸鏈,但中間尚需另一電子傳遞體稱為電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白(electrontransferring flavoprotein,ETFP,輔基為FAD)參與才能完成。
又稱鐵硫中心,其特點是含鐵原子。鐵是與無機硫原子或是蛋白質(zhì)肽鏈上半胱氨酸殘基的硫相結(jié)合,常見的鐵硫蛋白有三種組合方式(a)單個鐵原子與4個半胱氨酸殘基上的巰基硫相連。(b)兩個鐵原子、兩個無機硫原子組成(2Fe-2S),其中每個鐵原子還各與兩個半胱氨酸殘基的巰基硫相結(jié)合。(c)由4個鐵原子與4個無機硫原子相連(4Fe4S),鐵與硫相間排列在一個正六面體的8個頂角端;此外4個鐵原子還各與一個半胱氨酸殘基上的巰基硫相連(圖6-1)。
圖6-1 鐵硫蛋白結(jié)構(gòu)
(a)單個鐵與半胱氨酸硫相連 (b)2Fe-2S (c)4Fe-4S
鐵硫蛋白中的鐵可以呈兩價(還原型),也可呈三價(氧化型),由于鐵的氧化、還原而達到傳遞電子作用。
在呼吸鏈中它多與黃素蛋白或細胞色素b結(jié)合存在。
亦稱輔酶Q(coenzymeQ),為一脂溶性苯醌,帶有一很長的側(cè)鏈,是由多個異戊二烯(isoprene)單位構(gòu)成的,不同來源的泛醌其異戊二烯單位的數(shù)目不同,在哺乳類動物組織中最多見的泛醌其側(cè)鏈由10個異戊二烯單位組成。
泛醌接受一個電子和一個質(zhì)子還原成半醌,再接受一個電子和質(zhì)子則還原成二氫泛醌,后者又可脫去電子和質(zhì)子而被氧化恢復為泛醌。
1926年Keilin首次使用分光鏡觀察昆蟲飛翔肌振動時,發(fā)現(xiàn)有特殊的吸收光譜,因此把細胞內(nèi)的吸光物質(zhì)定名為細胞色素。細胞色素是一類含有鐵卟啉輔基的色蛋白,屬于遞電子體。線粒體內(nèi)膜中有細胞色素b、c1、c、aa3,肝、腎等組織的微粒體中有細胞色素P450。細胞色素b、c1、c為紅色細胞素,細胞色素aa3為綠色細胞素。不同的細胞色素具有不同的吸收光譜,不但其酶蛋白結(jié)構(gòu)不同,輔基的結(jié)構(gòu)也有一些差異。
細胞色素c為一外周蛋白,位于線粒體內(nèi)膜的外側(cè)。細胞色素C比較容易分離提純,其結(jié)構(gòu)已清楚。哺乳動物的Cyt c由104個氨基酸殘基組成,并從進化的角度作了許多研究。Cyt c的輔基血紅素(亞鐵原卟啉)通過共價鍵(硫醚鍵)與酶蛋白相連(見圖6-2),其余各種細胞色素中輔基與酶蛋白均通過非共價鍵結(jié)合。
圖6-2 細胞色素C的輔基與酶蛋白的聯(lián)接方式
細胞色素a和a3不易分開,統(tǒng)稱為細胞色素aa3。和細胞色素P450、b、c1、c不同,細胞色素aa3的輔基不是血紅素,而是血紅素A(見圖6?)。細胞色素aa3可將電子直接傳遞給氧,因此又稱為細胞色素氧化酶。
圖6-3 血紅素A結(jié)構(gòu)式
鐵卟啉輔基所含F(xiàn)e2+可有Fe2+←→Fe3++e的互變,因此起到傳遞電子的作用。鐵原子可以和酶蛋白及卟啉環(huán)形成6個配位鍵。細胞色素aa3和P450輔基中的鐵原子只形成5個配位鍵,還能與氧再形成一個配位鍵,將電子直接傳遞給氧,也可與CO、氰化物、H2S或疊氮化合物形成一個配位鍵。細胞色素aa3與氰化物結(jié)合就阻斷了整個呼吸鏈的電子傳遞,引起氰化物中毒。
1.標準氧化還原電位的數(shù)值表示氧化還原能力的大小,標準氧化還原電位負值越大,其還原性越強,容易被氧化;標準氧化還原電位正值越大,其氧化性越強,容易被還原。因此呼吸鏈中各種組分的排列順序應當由低電位依次向高電位排列(圖-4)。
圖6-4 各種傳遞體的標準氧化還原電位
2.還原程度來確定。Chance和Williams使用分光光度法測定離體的線粒體在有氧條件下三羧酸循環(huán)反應達到平衡時,呼吸鏈中各種傳遞體的還原程度。反應達到平衡quanxiangyun.cn/kuaiji/時從底物一側(cè)到氧一側(cè)的各種傳遞體的還原程度應當是遞減的,底物的一側(cè)最高,氧一側(cè)最低,如下表中數(shù)據(jù)所示。
表6-1 有氧動態(tài)平衡時電子傳遞體的還原程度
傳遞體 | NAD | FP | Cyt b | Cyt c | Cty aa3 |
還原型% | 53 | 20 | 16 | 6 | 1 |
FP:黃素蛋白
這種情況好象物理學上的聯(lián)通管,圖6?A中,若進水量等于出水量,即流量達到平衡時,離進水口最近的水管中水位最高,離出水管最近的水管中水位最低,從進水管到出水管水位逐漸減低,若把水流視為電子流,就是上述實驗中的情況。
3.使用特異的抑制劑 特異的抑制劑能阻斷呼吸鏈中的特定環(huán)節(jié),阻斷部位的底物一側(cè)的各種傳遞體應為還原型,阻斷部位的氧一側(cè)的各種傳遞體應為氧化型,正象我們阻斷聯(lián)通管的底部一樣,阻斷部位以前的各水管中水是滿的,而阻斷部位以后的各水管中水均流光(見圖6-5,B)。
圖6-5 有氧氧化穩(wěn)定時各種傳遞體的還原太分數(shù)
A.不加抑制劑 B.加入抗霉A阻斷
復合物Ⅰ:催化NADH氧化、CoQ還原。
復合物Ⅱ:催化琥珀酸氧化、CoQ還原
復合物Ⅲ:催化Co QH2氧化、Cyt c還原
復合物Ⅳ:催化Cyt c氧化、O2還原
表6-2 使用抗霉素A前后各種遞電子體的還原型百分數(shù)
FP | Cyt b | Cyt c+c1 | Cty aa3 | |
琥珀酸 | 40 | 25 | 19 | 4 |
琥珀酸+抗霉素A | 100 | 100 | 0 | 0 |
從表中可以看出,F(xiàn)P、Cyt b位于抗霉素A阻斷部位之前,Cytc、cl、aa3位于阻斷部位之后。用不同的抑制劑作此實驗,就可以確定呼吸鏈中各種傳遞體的排列順序。
4.在體外實驗中,將線粒體分成各種復合物,檢測其各自催化的反應,再將其重組,檢測其催化能力。
美國格林(Green)等實驗室成功地將呼吸鏈分離成具有催化活性的四種復合物以及CoQ和Cytc.檢測各個復合物的功能發(fā)現(xiàn):
可以看出CoQ在復合物Ⅰ與Ⅲ,Ⅱ與Ⅲ之間傳遞還原當量,Cyt c在復合物Ⅲ與Ⅳ之間傳遞還原當量。他們又將這四種復合物1:1:1:1的比例混合,加上CoQ和Cyt c重組,基本上恢復了線粒體原有的催化能力。
借助上述實驗方法,呼吸鏈各組分的排列順序已基本明確,但仍有些不一致的看法,其中以CoQ至細胞色素C這一部分研究得還很不清楚,對于Fe-S和CoQ的定位和數(shù)量也有爭議。
1.NADH氧化呼吸鏈 人體內(nèi)大多數(shù)脫氫酶都以NAD+作輔酶,在脫氫酶催化下底物SH2脫下的氫交給NAD+生成NADH+H+,在NADH脫氫酶作用下,NADH+H+將兩個氫原子傳遞給FMN生成FMNH2,再將氫傳遞至CoQ生成CoQH2,此時兩個氫原子解離成2H++2e,2H+游離于介質(zhì)中,2e經(jīng)Cyt b、c1、c、aa3傳遞,最后將2e傳遞給1/2O2,生成O2-,O2與介質(zhì)中游離的2H+結(jié)合生成水,綜合上述傳遞過程可用圖6-6表示。
圖6-6 NADH氧化呼吸鏈
SH2:作用物;(Fe-S):鐵硫中心;Cyt:細胞色素
2.琥珀酸氧化呼吸鏈 琥珀酸在琥珀酸脫氫酶作用下脫氫生成延胡索酸,F(xiàn)AD接受兩個氫原子生成FADH2,然后再將氫傳遞給CoQ,生成CoQH2,此后的傳遞和NADH氧化呼吸鏈相同,整個傳遞過程可用圖6-7表示。
圖6-7 琥珀酸氧化呼吸鏈
(Fe-S):鐵硫中心:b:琥珀酸脫氫酶復合體的細胞色素
3.線粒體氧化呼吸鏈總結(jié) 線粒體中物質(zhì)代謝會生成大量的NADH+H+和FADH2-它們可來自丙酮酸氧化脫羧、三羧酸循環(huán)、脂肪酸的β-氧化和L-谷氨酸的氧化脫氨等反應,現(xiàn)將某些重要底物氧化時的呼吸鏈總結(jié)于圖6-8。
圖6-8 線粒體中某些底物氧化時的呼吸鏈
*ETF:電子傳遞黃素蛋白,輔基為FAD
體內(nèi)很多物質(zhì)氧化分解產(chǎn)生NADH,反應發(fā)生在線粒體內(nèi),則產(chǎn)生的NADH可直接通過呼吸鏈進行氧化磷酸化,但亦有不少反應是在線粒體外進行的,如3-磷酸甘油醛脫氫反應,乳酸脫氫反應及氨基酸聯(lián)合脫氨基反應等等。由于所產(chǎn)生的NADH存在于線粒體外,而真核細胞中,NADH不能自由通過線粒體內(nèi)膜,因此,必須借助某些能自由通過線粒體內(nèi)膜的物質(zhì)才能被轉(zhuǎn)入線粒體,這就是所謂穿梭機制,體內(nèi)主要有兩種穿梭機制。
該穿梭機制主要在腦及骨骼肌中,它是借助于α-磷酸甘油與磷酸二羥丙酮之間的氧化還原轉(zhuǎn)移還原當量,使線粒體外來自NADH的還原當量進入線粒體的呼吸鏈氧化,具體過程如圖6-9。
圖6-9 α磷酸甘油穿
當胞液中NADH濃度升高時,胞液中的磷酸二羥丙酮首先被NADH還原成α磷酸甘油(3-磷酸甘油),反應由甘油磷酸脫氫酶(輔酶為NAD+)催化,生成的α磷酸甘油可再經(jīng)位于線粒體內(nèi)膜近外側(cè)部的甘油磷酸脫氫酶催化氧化生成磷酸二羥丙酮。線粒體與胞液中的甘油磷酸脫氫酶為同工酶,兩者不quanxiangyun.cn/jianyan/同在于線粒體內(nèi)的酶是以FAD為輔基的脫氫酶,而不是NADH+,F(xiàn)AD所接受的質(zhì)子、電子可直接經(jīng)泛醌、復合體Ⅲ、Ⅳ傳遞到氧,這樣線粒體外的還原當量就被轉(zhuǎn)運到線粒體氧化了,但通過這種穿梭機制果只能生成2分子ATP而不是3分子ATP。
這種穿梭機制主要在肝、腎、心中發(fā)揮作用,其穿梭機制比較復雜,不僅需借助蘋果酸、草酸乙酸的氧化還原,而且還要借助α酮酸與氨基酸之間的轉(zhuǎn)換,才能使胞液中來的NADH的還原當量轉(zhuǎn)移進入線粒體氧化,具體過程如圖6-10。
圖6-10 蘋果酸天冬氨酸穿梭
GOT:谷草轉(zhuǎn)氨酸;MDH:蘋果酸脫氫酶
當胞液中NADH濃度升高時,首先還原草酰乙酸成為蘋果酸,此反應由蘋果酸脫氫酶催化,胞液中增多的蘋果酸可通過內(nèi)膜上的二羧酸載體系統(tǒng)與線粒體內(nèi)的α酮戊二酸交換;進入線粒體的蘋果酸,經(jīng)蘋果酸脫氫酶催化又氧化生成草酰乙酸并釋出NADH,還原當量從復合體I進入呼吸鏈經(jīng)CoQ、復合體Ⅲ、Ⅳ傳遞,最image/005061360后給氧,所以仍可產(chǎn)生3分子ATP,與在線粒體內(nèi)產(chǎn)生的NADH氧化相同。與此同時線粒體內(nèi)的α酮戊二酸由于與蘋果酸交換而減少,需要補充,于是在轉(zhuǎn)氨酶作用下由谷氨酸與草酰乙酸進行轉(zhuǎn)氨基反應,生成α酮戊二酸和天冬氨酸,天冬氨酸借線粒體膜上的谷氨酸天冬氨酸載體轉(zhuǎn)移系統(tǒng)與胞液的谷氨酸交換,從而補充了線粒體內(nèi)谷氨酸由于轉(zhuǎn)氨基作用而造成的損失,進入胞液的天冬氨酸再與胞液中α酮戊二酸進行轉(zhuǎn)氨基,重新又產(chǎn)生草酰乙酸以補充最初的消耗,從而完成整個穿梭過程。