生物化學(xué)與分子生物學(xué):第二節(jié) RNA轉(zhuǎn)錄后的加工與修飾

不論原核或真核生物的rRNAs都是以更為復(fù)雜的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本形式被合成的，然后再加工成為成熟的RNA分子。然而絕大多數(shù)原核生物轉(zhuǎn)錄和翻譯是同時(shí)進(jìn)行的，隨著mRNA開始的DNA上合成，核蛋白體即附著在mRNA上并以其為模板進(jìn)行蛋白質(zhì)的合成，因此原核細(xì)胞的mRNA并無(wú)特殊的轉(zhuǎn)錄后加工過(guò)程，相反，真核生物轉(zhuǎn)錄和翻譯在時(shí)間和空間上是分天的，剛轉(zhuǎn)錄出來(lái)的mRNA是分子很大的前體，即核內(nèi)不均一RNA。hnRNA分子中大約只有10%的部分轉(zhuǎn)變成成熟的mRNA，其余部分將在轉(zhuǎn)錄后的加工過(guò)程中被降解掉。

（一)mRNA的加工修飾

原核生物中轉(zhuǎn)錄生成的mRNA為多順?lè)醋�，即幾個(gè)結(jié)構(gòu)基因，利用共同的啟動(dòng)子和共同終止信號(hào)經(jīng)轉(zhuǎn)錄生成一條mRNA，所以此mRNA分子編碼幾種不同的蛋白質(zhì)。例如乳糖操縱子上的Z、Y及A基因，轉(zhuǎn)錄生成的mRNA可翻譯生成三種酶，即半乳糖苷酶，透過(guò)酶和乙酰基轉(zhuǎn)移酶。原核生物中沒(méi)有核模，所以轉(zhuǎn)錄與翻譯是連續(xù)進(jìn)行的，往往轉(zhuǎn)錄還未完成，翻譯已經(jīng)開始了，因此原核生物中轉(zhuǎn)錄生成的mRNA沒(méi)有特殊的轉(zhuǎn)錄后加工修飾過(guò)程。

真核生物轉(zhuǎn)錄生成的mRNA為單順?lè)醋�，即一個(gè)mRNA分子只為一種蛋白質(zhì)分子編碼。

真核生物mRNA的加工修飾，主要包括對(duì)5’端和3’端的修飾以及對(duì)中間部分進(jìn)行剪接。

1．在5’端加帽

成熟的真核生物mRNA，其結(jié)構(gòu)的5’端都有一個(gè)m7G-PPNmN結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)被稱為甲基鳥苷的帽子。如圖17-9所示。鳥苷通過(guò)5’-5’焦磷酸鍵與初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的5’端相連。當(dāng)鳥苷上第7位碳原子被甲基化形成m7G-PPNmN時(shí)，此時(shí)形成的帽子被稱為“帽0”，如果附m7G-PPNmN外，這個(gè)核糖的第“2”號(hào)碳上也甲基化，形成m7G-PPNm，稱為“帽1”，如果5’末端N1和N2中的兩個(gè)核糖均甲基化，成為m7G-PPNmPNm2，稱為“帽2”。從真核生物帽子結(jié)構(gòu)形成的復(fù)雜可以看出，生物進(jìn)化程度越高，其帽子結(jié)構(gòu)越復(fù)雜。

圖17-9　Post-transcriptional modification of mRNa showing the7-methylguanosine cap and poly-A tail.

真核生物mRNA 5’端帽子結(jié)構(gòu)的重要性在于它是mRNa 做為翻譯起始的必要的結(jié)構(gòu)，對(duì)核糖體對(duì)mRNA的識(shí)別提供了信號(hào)，這種帽子結(jié)構(gòu)還可能增加mRNA的穩(wěn)定性，保護(hù)mRNa 免遭5’外切核酸酶的攻擊。

2．在3’端加尾

大多數(shù)的真核mRNA 都有3’端的多聚尾巴（A)，多聚（A)尾巴大約為200bp。

多聚（A)屠巴不是由DNA編碼的，而是轉(zhuǎn)錄后在核內(nèi)加上去的。受polyA聚合酶催化，該酶能識(shí)別，mRNa 的游離3’-OH端，并加上約200個(gè)A殘基。

近年來(lái)已知，在大多數(shù)真核基因的3’一端有一個(gè)AATAA序列，這個(gè)序列是mRNa 3’-端加polyA尾的信號(hào)�？亢怂崦冈诖诵盘�(hào)下游10-15堿基外切斷磷酸二酯鍵，在polyA聚合酶催化下，在3’-OH上逐一引入100-200個(gè)A堿基。關(guān)于polyA尾巴的功能問(wèn)題盡管經(jīng)過(guò)極其廣泛的探索，但還不完全清楚。有人推測(cè)polyA可能與mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)送到細(xì)胞質(zhì)有關(guān)，但是相當(dāng)數(shù)量，的沒(méi)有polyA屠巴的mRNA如組蛋白mRNA，也照樣通過(guò)核膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。還有人認(rèn)為這種結(jié)構(gòu)對(duì)真核mRNA的翻譯效率具有某種作用，并能穩(wěn)定mRNA結(jié)構(gòu)，保持一定的生物半衰期。

3.mRNA前體（hnRNA)的拼接

原核生物的結(jié)構(gòu)基因是連續(xù)編碼序列，而真核生物基因往往是斷裂基因，即編碼一個(gè)蛋白質(zhì)分子的核苷酸序列被多個(gè)插入片斷所隔開，一個(gè)真核生物結(jié)構(gòu)基因中內(nèi)含子的數(shù)量，往往與這個(gè)基因的大小有關(guān)，例如胰島素是一個(gè)很小的蛋白質(zhì)，它結(jié)構(gòu)基因只有兩個(gè)內(nèi)含子，而有些很大的蛋白質(zhì)，它的結(jié)構(gòu)基因中可以有幾十個(gè)內(nèi)含子。經(jīng)過(guò)復(fù)雜的過(guò)程后，切去內(nèi)元，將有編碼意義的核苷酸片段（Extron外元也叫外顯子)連接起來(lái)（圖17-10)。

圖17-10　Primary polymerase 11transcript of a eukaryote gene showing(a)introns after capping and addition of polyA tail.(b)Excision of introns toform the mature mRNA is called splicing.

真核生物的結(jié)構(gòu)的基因中具有可表達(dá)活性的外顯子，也含有無(wú)表達(dá)活性的內(nèi)含子，但內(nèi)含子序列下是無(wú)意義的，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證明有許多基因中的內(nèi)含子參與基因表達(dá)調(diào)控，在轉(zhuǎn)錄時(shí)，外顯子及內(nèi)含子均轉(zhuǎn)錄到hnRNA中。在細(xì)胞核中hnRNA進(jìn)行剪接作用，首先在核酸內(nèi)切酶作用下剪切掉內(nèi)含子；然后在連接酶作用下，將外顯子各部分連接起來(lái)，而變?yōu)槌墒斓膍RNA，這就是剪接作用，也有少數(shù)基因的hnRNA不需進(jìn)行剪接作用，例如α-干擾素基因，圖17-11以卵清蛋白基因?yàn)槔�，介紹一個(gè)典型的轉(zhuǎn)錄及加工過(guò)程。

圖17-11　卵清蛋白基因轉(zhuǎn)錄及加工過(guò)程

圖中外顯示以1、2、3、4……表示，內(nèi)含子以A、B、C、D…表示

mRNA的拼接，需要在拼接部位有供拼接識(shí)別的保守性強(qiáng)的一致順序，通過(guò)對(duì)100多種真核細(xì)胞基因的分析，發(fā)現(xiàn)外元和內(nèi)元拼接部位部分堿基順序有一定的規(guī)律（見表17-4)。

表17－4　含有內(nèi)元的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物其拼接處的堿基順序

表中劃線的堿基對(duì)拼接識(shí)別有重要作用，如將兔的β-珠蛋白的拼接部位的GT改為AT后，拼接反應(yīng)即受到影響。

mRNA前體拼機(jī)制

圖17-12　The RNA splicing mechanism.RNA splicing is catalyzed by aspliceosome formed from the assembly of U1,U2,U5,and sn RNPs(shown as greencircles )plus other components (not shown).After assembly of the spliceosome,the reaction occures in two speps:in step 1the branch-point A nucleotide inthe intron sequence,which is located colse to the 3"splice site ,attacks the5"splice site and cleaves it;the cut 5"end of the intron sequence therebybecomes covalently linked to this A nucleotide,forming the branched nucleotideshown in Figure 8-55.In step 2 the 3"-OH end of the first exon sequence,whichwas created in the first step,adds to the beginning of the second exonsequence,cleqving the RNA molecule at the 3"splice site;the two exon sequencesare thereby joined to each other and the intron sequence is released ad aribosone.These splicing reactions occur im the nucleus and gengerate mRNamolecules from primary RNA transcripts (mRNA precursor molecules).

mRNA拼接反應(yīng)需要有核內(nèi)小分子RNA參與它們與蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物稱為小核糖核蛋白顆粒，SnRNA分別被命名為U1,U2,U3,U4,U5,和U6RNA。SnRNA中的U2RNA由與內(nèi)元右端拼接部位附近的UACUAA順序高度互補(bǔ)，形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，由特定的酶來(lái)識(shí)別切除該環(huán)狀結(jié)構(gòu)，完成拼接過(guò)程，如圖17-12所示。

圖17-13　Mechanim of mRNa splicing.Note that,for clarity,the process is shownin two stages;energy is not required for the process since transesterificationreactions are involved.

真核生物 mRNA前體在剪接過(guò)程中，還可以形成套索樣的結(jié)構(gòu)，在內(nèi)含子序列中常有一個(gè)分支部位的腺苷酸殘基，它的2’-OH可以自動(dòng)攻擊內(nèi)含子5’端與外顯子1連接的磷酸二酯鍵，切開了外噗子1，而腺苷酸原來(lái)已有3’，5’--磷酸二酯鍵相連的兩個(gè)相鄰的核苷酸殘基，加上此3’，5’-磷酸二酯鍵連接后，在腺苷酸處出現(xiàn)了一個(gè)套索，已被切下的外顯子1的3’-OH攻擊內(nèi)含子3’末端與外顯子2之間的3’，5’-磷酸二酯鍵，鍵斷裂后，內(nèi)含子以套索的形式被節(jié)下來(lái)，此時(shí)外顯子1和外顯子2可以連接起來(lái)（圖17-13)。

不論拼接過(guò)程如何，拼接必須極為精確，否則會(huì)導(dǎo)致遺傳信息傳遞障礙，合成的蛋白質(zhì)可能喪失其正常的功能。我國(guó)南方廣大地區(qū)是β-地中海貧血的高發(fā)區(qū)，這是由于β-珠蛋白鏈的合成受到部分或完全抑制所引起的一種血紅蛋白病。實(shí)驗(yàn)表明β-珠蛋白基因元1中核苷酸的點(diǎn)突變改變了正常拼接部位的堿基順序，結(jié)果造成錯(cuò)誤部位的拼接。加工成熟的mRNA雖能翻譯，但產(chǎn)物不是正常的β-珠蛋白，結(jié)果引起血紅蛋白級(jí)結(jié)構(gòu)和功能的改變。

（二)rRNA轉(zhuǎn)錄后加工

原核生物rRNA轉(zhuǎn)錄后加工，包括以下幾方面：①rRNA前體被大腸桿菌RNaseⅢ,RNaseE等剪切成一定鏈長(zhǎng)的rRNA分子；②rRNA在修飾酶催化下進(jìn)行堿基修飾；③rRNA與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核糖體的大、小亞基（見圖17-14)

圖17-14　大腸桿菌rRNA前體的加工

真核生物rRNA前體比原核生物大，哺乳動(dòng)物的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為45s，低等真核生物的rRNA前體為38s，真核生物5sRNA前體獨(dú)立于其他三種rRNA的基因轉(zhuǎn)錄（圖17-15)。

圖17-15　真核生物rRNA前體的加工

真核生物rRNA前體中含有插入順序，rRNA前體要形成成熟的rRNA，需要經(jīng)過(guò)拼接反應(yīng)。例如，四膜蟲的rRNA前體的拼接是一種無(wú)酶催化的自動(dòng)拼接過(guò)程。四膜蟲基因組內(nèi)，26srRNA編碼的區(qū)域內(nèi)有413bp的插入順序。該插放序列可以不消耗能量從rRNA前體中被除掉。用SDS煮沸和用蛋白酶外理等破壞酶活性辦法，都不能破壞拼接活性，但反應(yīng)中Mg2+和鳥嘌呤核苷酸是必在的。用32P-GTP進(jìn)行追蹤實(shí)驗(yàn)表明，起始過(guò)程是GTP在插入順序5’端發(fā)生親核反應(yīng)，同時(shí)GMP與5’端切點(diǎn)的切除段形成磷酸二酯鍵并使原RNA斷開。第二步是5’切點(diǎn)的外元3’-OH與3’切點(diǎn)的外元5’-P共價(jià)連接，獲得成熟的rRNA，被切除部分最后環(huán)化，形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)從5’端去掉一個(gè)15核苷酸啐片。剩余部分連接成399核苷酸的環(huán)狀產(chǎn)物，再經(jīng)過(guò)幾步，最后切下一個(gè)19個(gè)核苷酸的線性內(nèi)含子序列即L-19，它具有催化活性，上面的剪接作用，是由內(nèi)含子本身的催化性質(zhì)決定的（圖17-16)。

圖17-16　四膜蟲rRNA前體的自我剪接

這種rRNA的自身剪接反應(yīng)給人們一個(gè)提示：即RNA分子也有酶的催化活性。這向酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)這一傳統(tǒng)概念提出了挑戰(zhàn)。這種有酶催化活性的RNA分子命名為Ribozyme。T.Cech和S.Altman各自分別發(fā)現(xiàn)RNA具有催化作用，他們的發(fā)現(xiàn)對(duì)于了解生命進(jìn)行過(guò)程有重要quanxiangyun.cn/Article/意義。很可能在原始生命中，RNA所催化的斷裂一連接反應(yīng)是最早出現(xiàn)的催化過(guò)程。為此，他們共同獲得了1989年Nobel化學(xué)獎(jiǎng)。

從大多數(shù)Ribozymw的結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)一些特征，例如：錘頭狀結(jié)構(gòu)的RNA分子有13個(gè)保守的核苷酸序列，如果它們中的堿基改變會(huì)使這種催化活性失去作用。根據(jù)這種特片，科學(xué)家們?cè)隗w外沒(méi)計(jì)并人工合成這種RNA分子，用于抗腫瘤及抗病毒的實(shí)驗(yàn)中（圖17-17)。

圖17-17　錘頭結(jié)構(gòu)模式圖

（三)tRNA轉(zhuǎn)錄后的加工修飾

原核生物和真核生物剛轉(zhuǎn)錄生成的tRNA前體一般無(wú)生物活性，需要進(jìn)行①剪切和拼接②堿基修飾③3’-OH連接-ACC結(jié)構(gòu)（圖17-18)。

圖17-18　tRNA前體的加工

①tRNA前體在tRNA剪切酶的作用下，切成一定在小的tRNA分子。大腸桿菌RNase P可特異剪切tRNA前體的5’旁順序，因此，該酶被稱為tRNA5’成熟酶。除了RNaseP外，tRNA前體的剪切尚需要一個(gè)3’-核酸內(nèi)切酶，這可將tRNA前體3’端的一段核苷酸序列切下來(lái)。此外RNaseD是tRNA3’端成熟酶。近年來(lái)的研究表明大腸桿菌RNaseP是一種非常特殊的酶分子，它是由Rquanxiangyun.cn/pharm/NA和蛋白質(zhì)組成，最近發(fā)現(xiàn)RNAaseP分子中的RNA部分在某些條件下，可以單獨(dú)地催化tRNA前體的加工成熟，這個(gè)發(fā)現(xiàn)和四膜蟲tRNA能自我拼接被認(rèn)為是近十年來(lái)生化領(lǐng)域內(nèi)最令人鼓舞的發(fā)現(xiàn)之一。說(shuō)明RNA分子確具有酶的催化活性。經(jīng)過(guò)剪切后的tRNA分子還要在拼接酶作用下，將成熟tRNA分子所需的片段拼起來(lái)。

②成熟的tRNA分子中有許多的稀有堿基，因此tRNA在甲基轉(zhuǎn)移酶催化下，某些嘌呤生成甲基嘌呤如A→mA,G→mA。有些尿嘧啶還原為雙氫尿嘧啶。尿嘧啶核苷轉(zhuǎn)變不假尿嘧啶核苷。某些腺苷酸脫氨基為成為次黃嘌呤核苷酸（Ⅰ)

③3’末端加上CCA：在核苷酸轉(zhuǎn)移酶作用下，3’--末端除去個(gè)別堿基后，換上tRNA分子統(tǒng)一的CCA-OH末端，完成tRNA分子中的氨基酸臂結(jié)構(gòu)。